Aplicación de técnicas espectroscópicas (Absorcion UV-VIS y Resonancia Nuclear Magnética) para el estudio cinético y caracterización de una reacción enzimática

GERARDO O. DANELON; MANUEL GONZALEZ SIERRA; ANABELLA F. LODEYRO; OSCAR A. ROVERI.

Buenos Aires, ARGENTINA.

Congreso; XXXI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2002

Sociedad Argentina de Biofísica

APLICACION DE TECNICAS ESPECTROSCOPICAS (ABSORCION UV-VIS Y RESONANCIA NUCLEAR MAGNETICA) PARA EL ESTUDIO CINETICO Y CARACTERIZACION DE UNA REACCION ENZIMATICA             Cuestiones fundamentales en el estudio del mecanismo de acción de una enzima son la caracterización química de los productos de la reacción y la determinación de su mecanismo cinético. Las espectroscopías ópticas han sido útiles para los estudios cinéticos, pero no permiten identificar la estructura de los productos. En cambio, la espectroscopía de Resonancia Nuclear Magnética (RMN) no sólo permite monitorear el progreso temporal de la reacción sino además caracterizar químicamente sus productos. En esta comunicación describimos un trabajo práctico para alumnos de Química o de Biología desarrollado con el objeto de introducirlos en la aplicación de la espectroscopía de absorción UV-VIS y de RMN para el estudio de reacciones enzimáticas. La enzima elegida para el trabajo es la b-lactamasa I de Bacillus cereus, la cual puede ser adquirida comercialmente o purificada en dos etapas sencillas (absorción sobre celita y cromatografía de intercambio iónico utilizando CM-Sephadex).             En primer lugar se determina el espectro del sustrato (benzilpenicilina) antes y después de ser incubado con b-lactamasa I. El espectro diferencial muestra un máximo a 230 nm. Se estima el coeficiente de absorción diferencial (De230), el cual será utilizado en los estudios cinéticos posteriores.             Por otra parte, se prepara una solución de benzilpenicilina (60 mM) en amortiguador de fosfato (pH = 7.0) en agua deuterada. La reacción se inicia por el agregado de 2.5 UI de b-lactamasa I y es monitoreada determinando a distintos tiempos espectros de H-RMN. Una progresiva modificación de dichos espectros es observada, obteniéndose a los 90 min de reacción un espectro estable y distinto al de benzilpenicilina. El análisis de las señales del nuevo espectro permite establecer la estructura del producto de la reacción enzimática. La integración de algunas de dichas señales, a distintos tiempos de reacción, permite determinar la cinética de la misma. La comparación de esta cinética con la obtenida en un experimento similar realizado utilizando agua y monitoreando el progreso temporal de la reacción por disminución de la absorbancia a 230 nm, permite observar que la reacción es significativamente más rápida en agua que en agua deuterada. Esta observación hace presumir la existencia de un efecto cinético isotópico de solvente (SKIE) indicativo de que al menos un H+(D+) estaría involucrado en el mecanismo de reacción. Dicha presunción es confirmada al estimar (utilizando la ecuación integrada de Michelis-Menten) los valores de Vmax y Km en agua y en agua deuterada.             El trabajo práctico desarrollado permite introducir al alumno en: i) la utilización de las espectroscopías UV-VIS y de RMN para el estudio cinético de una reacción enzimática y la caracterización estructural del producto de la reacción; ii) la utilización del análisis del progreso temporal de la reacción para la estimación de Vmax y Km; y iii) la observación de un claro ejemplo de efecto isotópico.