Regulación por aniones de la H+-ATPasa mitocondrial. Efecto de sulfato sobre la hidrólisis y síntesis de ATP

A. F. LODEYRO; O. A. ROVERI

Tafí del Valle, ARGENTINA

Congreso; XXX Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Biofísica; 2001

Sociedad Argentina de Biofísica

REGULACION POR ANIONES DE LA H+-ATPasa MITOCONDRIAL. EFECTO DE SULFATO SOBRE LA HIDROLISIS Y SINTESIS DE ATP.   La H+-ATPasa mitocondrial es la enzima responsable de sintetizar ATP a expensas del gradiente electroquímico de H+ generado por la cadena respiratoria a través de la membrana interna mitocondrial. La misma está compuesta por dos sectores: F1 y Fo. F1 es una proteína oligomérica hidrosoluble que sólo es capaz de catalizar la hidrólisis de ATP. Fo es un oligómero hidrofóbico intrínseco de la membrana que está involucrado en la translocación de H+ a través de la misma. La actividad ATPásica de F1 depende de la concentración de ATP de manera compleja, mostrando un comportamiento que sugiere la existencia de cooperatividad negativa entre sitios de unión de nucleótidos. Este comportamiento es afectado por la presencia de diversos aniones en el medio de reacción. El anión bicarbonato estimula la reacción de hidrólisis de ATP. Previamente hemos postulado que dicho anión ejercería su efecto atenuando la cooperatividad negativa existente entre los sitios de unión de ATP (1). Recktenwald y Hess (2) han postulado que un sitio regulatorio sería capaz de unir ATP y aniones, tales como bicarbonato y sulfato. La unión de ATP a dicho sitio aumentaría el Km(ATP), siendo de tal manera responsable de la aparente cooperatividad negativa. La unión de bicarbonato en lugar de ATP estabilizaría a F1 en su forma de bajo Km mientras que la de sulfato lo haría en su forma de alto Km. Por tanto, este último anión se comportaría como un inhibidor de la hidrólisis a concentraciones no saturantes de ATP. Recientemente hemos informado que bicarbonato inhibe la síntesis de ATP y hemos sugerido que lo haría previniendo la unión de ADP a un sitio no catalítico cuyo rol sería regular las afinidades relativas de ATP y ADP por el sitio catalítico (3). Dada la diferencia de comportamiento informada entre sulfato y bicabonato (2) decidimos realizar un cuidadoso estudio cinético del efecto de sulfato sobre la actividad ATPásica de F1 y la de síntesis de ATP de partículas submitocondriales fosforilantes. La velocidad de hidrólisis de ATP fue afectada de manera compleja por sulfato. La presencia de 30 mM sulfato inhibió la reacción a concentraciones de ATP menores a 2 mM mientras que la estimuló a concentraciones mayores. Al variar la concentración de sulfato a distintas concentraciones fijas de ATP se observó que: 1) la reacción fue estimulada a bajas e inhibida a altas concentraciones de sulfato a [ATP] < 0,02 mM; 2) a [ATP] comprendidas entre 0,05 y 2 mM, sulfato sólo inhibió la reacción; y 3) a [ATP] > 2 mM la reacción fue sólo activada. En todos los casos, las inhibiciones obtenidas fueron parciales.  Cuando se estudió el efecto de sulfato sobre la síntesis de ATP catalizada por partículas submitocondriales se observó que dicho anión se comportaba como un fuerte inhibidor de la reacción. La inhibición fue competitiva lineal respecto de Pi con un Ki = 0,5 mM. Para el sitio de unión de Pi involucrado en la competencia con sulfato se pudo estimar un Kd(Pi) aparente igual a 0,1 mM.                 La inhibición parcial de la hidrólisis de ATP permite concluir que sulfato no se une a un sitio catalítico en la ATPasa mitocondrial. Además, el complejo comportamiento observado sugiere que el anión se une a más de un sitio en la enzima.                 Sulfato inhibe la reacción de síntesis de ATP al igual que bicarbonato. Sin embargo, el comportamiento cinético indica que sulfato y Pi son ligandos mutuamente excluyentes, mientras que bicarbonato y Pi no lo son, lo cual podría ser explicado si ambos aniones se unen a distintos sitios en la enzima. Dicha posibilidad está siendo sometida a prueba experimental actualmente.   1)                   Roveri, O.A. and Calcaterra, N.B.. FEBS Lett 192, 123 – 127 (1985) 2)                   Recktenwald, D. and Hess, B. FEBS Lett 76, 25-28  (1977) 3)                   Lodeyro, A.F., Calcaterra, N.B. and Roveri, O.A. Biochim. Biophys. Acta en prensa.