Inactivación de la ATPasa soluble mitocondrial (F1) por incubación a 0 °C. Influencia del contenido de nucleótidos firmemente unidos

ANABELLA F. LODEYRO; OSCAR ANGEL ROVERI

Alicante, ESPAÑA

Congreso; IV Congreso Iberoamericano de Biofísica; 2000

Soc. de Biofísica Española, Soc. Portuguesa de Biofísica y Soc. de Biofísicos Latinoamericanos

INACTIVACION DE LA ATPasa SOLUBLE MITOCONDRIAL (F1) POR INCUBACION A 0º C. INFLUENCIA DEL CONTENIDO DE NUCLEOTIDOS FIRMEMENTE UNIDOS.             La ATPasa soluble mitocondrial  (F1) contiene seis sitios de unión para nucleótidos de los cuales entre 2 y 4 contienen nucleótidos unidos que no se disocian por precipitación repetida con sulfato de amonio, por diálisis o por cromatografía de exclusión molecular. Una propiedad interesante de F1 es su sensibilidad a bajas temperaturas, a las cuales se inactiva rápidamente.  Los objetivos de este  trabajo son la determinación del mecanismo cinético del proceso de inactivación por frío, y el estudio de la influencia de la composición de los nucleótidos firmemente unidos sobre el mismo. Se incubaron a 0ºC preparaciones de F1 con distinto contenido de nucleótidos unidos, y se ensayó a 30ºC y a distintas [ATP] la actividad remanente a distintos tiempos de incubación. Los ensayos fueron realizados utilizando un sistema regenerante de ATP (piruvato quinasa + lactato deshidrogenasa). En todos los casos la actividad decayó de acuerdo a una suma de dos exponenciales lo cual permitió estimar dos valores de constantes de velocidad (k1 y k2) de decaimiento. Cuando se utilizó una preparación de F1 que contenía 1 mol de ATP y 2 moles de ADP firmemente unidos, k1 y k2 aumentaron de manera hiperbólica con la [ATP] en el medio de ensayo. Las KATP aparentes fueron 15 mM y 17 mM ATP para k1 y k2, respectivamente. En cambio cuando se utilizó una preparación de F1 que contenía 2 moles de ATP y 2 moles de ADP firmemente unidos, los valores de k1 y k2 obtenidos fueron independientes de la [ATP] en el medio de ensayo. Si esta última preparación es preincubada con Mg2+ previamente a la eliminación de los nucleótidos débilmente unidos de acuerdo al procedimiento descripto por Berden y col. (Edel, C.M., Hartog, A.F. and Berden, J.A. (1995) Biochim Biophys Acta 1229, 103 - 114), al cabo de dos horas de incubación a 0°C no se observó decaimiento alguno de la actividad determinada a 4 mM ATP, mientras que la actividad a 100 mM decayó un 30% en el mismo tiempo. Por tanto, el contenido de nucleótidos firmemente unidos condiciona la sensibilidad de F1 al frío y el comportamiento de la enzima parcialmente inactivada frente a distintas [ATP] en el medio de ensayo de actividad.