OBTENCIÓN DE ANTIGENOS DE TOXOCARA CANIS Y DESARROLLO DE UN TEST ELISA PARA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS

INGARAMO, PAOLA INÉS; PIEDRABUENA, MILAGROS; MARTÍN, UBALDO

Santa Fe

Jornada; 11º ENCUENTRO DE JÓVENES INVESTIGADORES DE LAUNIVERSIDAD NACIONAL DEL LITORAL 2º ENCUENTRO DE JÓVENES INVESTIGADORES DE UNIVERSIDADES DE SANTA FE; 2007

UNL - UTN FRSF - Universidad Católica de Santa Fe

Toxocara canis es un parásito nemátode considerado el principal agente causal de toxocarosis en humanos. Los huevos son eliminados en las heces de cachorros infectados. El humano es un huésped intermediario para T. canis de manera que la larva no se transforma en parásito adulto en el intestino del hombre como sí lo hace en el cachorro. Las larvas liberadas en el intestino del hombre se dirigen hacia distintos órganos provocando distintos síndromes dependiendo del tejido afectado. Los niños entre 1 y 5 años parecen ser los más afectados y los factores de riesgo principales son la geofagia y el estrecho contacto con perros. El diagnóstico clínico en humanos es dificultoso debido a que la sintomatología es inespecífica y en la mayoría de los casos la infección es de curso asintomático. El diagnóstico de la enfermedad en el ser humano es problemático, ya que el estadio larval de T. canis no puede ser detectado directamente. El único método posible entonces es el diagnóstico indirecto mediante la detección de anticuerpos en sangre u otros fluidos biológicos. La técnica serológica más utilizada actualmente es un ensayo inmunoenzimático (ELISA) que utiliza como antígenos de excreción?secreción de larvas de segundo estadio (ES/L2) que se obtienen manteniendo a las larvas en un medio de cultivo libre de proteínas. Intentar optimizar la producción de antígenos de diagnóstico es uno de los objetivos de esta investigación. El objetivo general del presente trabajo es la obtención de antígenos de excreción/secreción de Toxocara canis a partir de larvas del segundo estadío. Desarrollar posteriormente, empleando los antígenos obtenidos, un sistema ELISA preciso que permita el diagnóstico de toxocarosis en base a la presencia de anticuerpos en suero. hembras adultas de T. canis se les extrajo el útero con bisturí y los huevos junto con los úteros fueron colocados en cajas de petri con formol al 1%. Un pequeño lote de esos gusanos fue colocado a -20 ºC durante 15 días antes de diseccionarle el útero. Los huevos obtenidos se mantuvieron a temperatura ambiente y con agitación periódica durante 30 días. Se hicieron recuentos diferenciales en forma semanal para obtener el porcentaje de huevos larvados y no larvados. A los 30 días de la obtención, los huevos fueron pasados a tubos de 50 ml. Se los dejó sedimentar 15 minutos. La obtención de las larvas se realizó de acuerdo a la metodología descripta por Savigny con modificaciones. Se armaron 30 dispositivos esterilizados por calor preparados para permitir solo el paso de las larvas al medio de cultivo que luego se desarmaron a las 20 horas quedando las larvas alojadas en el interior de los tubos. A las 24 horas posteriores a desarmar los dispositivos, se recolectaron los sobrenadantes en tubos estériles y se congelaron a -20. A su vez, a los tubos conteniendo las larvas se les adicionó un volumen de medio RPMI 1640 fresco equivalente al extraído. Esta operación se repitió a intervalos de 4 a 5 días durante 30 días. Una vez descongelados, los sobrenadantes conteniendo los antígenos se filtraron en dispositivo Millipore Stericup Filtration System (USA) 0,22 µm y se concentraron (Amicon, Millipore USA). Los sobrenadantes concentrados se mezclaron en un único pool que se almacenó a -20. La solución antigénica fue diluida 1/10 en Buffer de Carbonato de pH 9,6 y secolocó 100µl de esta por pocillo en placas de poliestireno. Estas fueron almacenadas por 24 hs en la heladera para la fijación de los antígenos. Luego de pasado este periodo las placas fueron divididas en 3 grupos para analizar si la fijación de los antígenos a la placa se afecta con la temperatura y cuando la solución antigénica permanece en la placa un tiempo mayor al usual. 1) un grupo fue colocado sin escurrir en la heladera; 2) otro grupo fue colocado sin escurrir en el freezer y; 3) otro grupo fue escurrido y colocado en el freezer. Los tres grupos de placas permanecieron 1 semana en estas condiciones. Pasado el periodo todas las placas fueron sometidas a tres lavados de 5 minutos cada una con PBS Tween 20 (0,05%). Luego fueron fueron incubadas 1h a 37 C con 100 µl/pocillo de PBS leche 1% a los fines de bloquear los sitios inespecíficos. Se hicieron 3 lavados de 5min c/u con PBS Tween. Posteriormente las placas fueron envueltas y almacenadas a -20 para su posterior evaluación con sueros de pacientes. Para determinar las concentraciones de suero óptimas la muestras se diluyeron 1/50, 1/100, 1/200 y 1/400. Las muestras ensayadas fueron 3 sueros serologizados por el Instituto Nacional de Enfermedades infecciosa ANLIS -Dr. Carlos G. Malbrán? siendo ELISA positivo y Western Blot positivo. Como muestras negativas se utilizaron 3 sueros que fueron negativos por ELISA según dicho instituto. El test de ELISA se ensayó sobre 93 muestras de sangre periférica obtenida de una población de niños elegida al azar cuando concurrían al Laboratorio del Hospital de Niños -Dr. Orlando Alassia? de la ciudad de Santa Fe. Como criterio de inclusión ninguno concurrió en demanda de atención médica relacionada con parasitosis y tampoco se sospechó de contacto directo o cercano con gatos. La edad de los pacientes estuvo comprendida entre los 2 meses y 18 años. De las 93 muestras analizadas 48 fueron de pacientes del sexo femenino y 45 del sexo masculino. La relación femenino/masculino fue de 1,06. Las edades promedios fueron 8,7 años en muestras pertenecientes a pacientes del sexo femenino y 7,2 en las de masculino.Las muestras se procesaron por duplicado, junto se procesaron 2 controles positivos y 2 controles negativos. Entre nuestros resultados obtuvimos que Los huevos mantenidos a temperatura ambiente presentaron un porcentaje de larvación del 35.5% a la semana de obtención y un pH de aproximadamente 6,5. El pH ascendió a 7 y el porcentaje de huevos larvados a 62% presentando movilidad la mayoría de las larvas a la siguiente semana. A los 25 días el pH y el porcentaje de larvación se mantuvieron constantes e iguales hasta llegado los 30 días. Los huevos obtenidos de hembras congeladas no prosperaron ya que se observó solo un 6%de huevos larvados a los 28 días de la obtención. Es evidente que la temperatura afecta el tiempo de evolución y por esto la temperatura excesivamente baja en algunos países del mundo quizás pueda ser un factor positivo en la disminución de la incidencia de Toxocarosis. Con la metodología utilizada para la obtención de larvas in vitro, a las 24 horas posteriores a desarmar los dispositivos se encontró una densidad promedio de 1000 larvas/ml en cada tubo. Esto significó un buen rendimiento que permitió posteriormente la obtención de sobrenadantes con concentraciones adecuadas. La concentración final en los sobrenadantes es también regulada a través del periodo de recambio de sobrenadantes (4-5 días) dentro del cual las larvas del segundo estadío producen antígenos de Excreción - Secreción. Un tiempo menor no genera un buen rendimiento en la producción de antígenos mientras que un tiempo mayor aumenta la propabilidad de generación de compuestos de desecho tóxicos para las larvas de T. canis. La concentración de proteínas en el pool de sobrenadantes medida por el método Bradford fue de 0.040mg/ml. La concentración de la solución antigénica a utilizar para sensibilizar las placas se eligió teniendo en cuenta las experiencias de otros laboratorios siendo la concentración elegida obtenida por dilución de la solución madre 4µg/ml de sobrenadante. De esta manera obtuvimos en las placas 0,4µg del antígeno por pocillo. No se observan diferencias en los resultados obtenidos para las placas almacenadas sin escurrir en freezer y en heladera. Ambas presentaron 2 falsos positivos para la misma muestra y ningún falso negativo. La placa almacenada en freezer escurrida presentó minimas diferencias con respecto a estas últimas. En ella se observaron un falso negativo para una de las muestras y un falso positivo para la misma muestra que en las otras placas dieron falso positivo. Con respecto a la concentración óptima de los sueros, se observó que la dilución 1/50 para los sueros no es buena ya que si bien los positivos son bien intensos los negativos poseen coloración de fondo. En la dilución 1/100 también ocurre esto. Las diluciones más efectivas estuvieron comprendidas entre 1/200 y 1/400 ya que se observan claras diferencias entre positivos y negativos. De los 93 sueros correspondientes a niños sin sospecha clínica, resultaron positivos con la técnica de ELISA aplicada en nuestro laboratorio, un 40.8%. La prevalencia en niños de hasta 10 años de edad fue de 35% y entre 10 y 20 años fue del 47,5%. La prevalencia en pacientes del sexo másculino fue del 57,9% mientras que las de sexo femenino fue de 42,1% pero la diferencia no es estadísticamente significativa. De los resultados anteriores observamos que el porcentaje de positividad por ELISA es elevado. Como conclusiòn, en el presente trabajo se encontró que existe una alta prevalencia de toxocariasis en niños lo cual hace notar la importancia de contar con métodos confiables de diagnóstico. La obtención de antígenos de excreción - secreción es importante como base para el desarrollo de un test de ELISA como herramienta diagnóstica que permita la detección de anticuerpos contra estos antígenos en sangre de pacientes.