Cuantificación de asparagina en cultivos celulares con electrodos compósitos de nanotubos de carbono modificados con cobre

MARIA LORENA LÓPEZ RODRIGUEZ, GUILLERMINA L. LUQUE, ROSSANA E. MADRID, CARMELO J. FELICE, NANCY F. FERREYRA, CARLA E. GIACOMELLI, GUSTAVO A. RIVAS

Bahia Blanca

Congreso; V Congreso Argentino Química Analítica; 2009

Asociación Argentina de Química Analítica

Algunos medios de cultivo líquidos utilizados frecuentemente en cultivos celulares utilizan asparagina (Asp) y glucosa (Glu) como fuentes de nitrógeno (N) y de carbono (C),  espectivamente(1). En estudios de actividad de Streptomyces sp. M7 (SM7) realizados por impedancimetría, se encontró que la Asp se comporta como un interferente ya que se observaron respuestas similares para cultivos en medio mínimo líquido (MM) en presencia y en ausencia de la fuente de C. El objetivo de este estudio es dilucidar si la SM7 efectivamente consume Asp tanto como fuente de N como de C. La determinación de Asp se efectuó amperométricamente utilizando electrodos compósitos de nanotubos de carbono modificados con micropartículas de cobre. La principal ventaja que presenta este sensor es la cuantificación de aminoácidos independientemente de su electroactividad y sin necesidad de derivatización previa(2). Se realizaron cultivos de distintas concentraciones iniciales de SM7 en MM con Asp 3,33 mM en presencia y ausencia de Glu a 30°C sin agitación. Las muestras se tomaron cada 24h durante 9 días, se centrifugaron y los sobrenadantes se conservaron a -18oC hasta el momento de la medición. La concentración de Glu residual se midió por método de Trinder(3). Para la cuantifiación de Asp residual se empleó amperometría con transporte convectivo controlado, aplicando 0,0V (vs. Ag/ AgCl/ NaCl 3 M) como potencial de trabajo y evaluando los cambios en corriente ante el agregado del sobrenadante. La concentración de Asp residual se determinó a partir de calibrados obtenidos mediante adiciones sucesivas de Asp 5,0 x 10-7 M, preparada en MM, encontrándose una alta estabilidad y reproducibilidad. La sensibilidad que presentó el sensor fue de (8,24 ± 2,10) x10-6 AM-1, similar a la obtenida para soluciones de Asp preparadas en ?buffer? fosfato 0,050 M pH 7,40. Más del (90 ± 10) % de la Asp se consumió dentro de las 72h para todas las concentraciones bacterianas estudiadas. Sin embargo, el consumo del  aminoácido en presencia de Glu es despreciable (menor al 10%) durante los 9 días. La glucosa se consumió en 7 días, en acuerdo con experimentos anteriores(4). Los resultados permiten concluir que la bacteria consume el aminoácido como fuente de N y de C. En consecuencia, para evaluar la actividad de la SM7 por impedancimetría se debería reemplazar la Asp por otra fuente de N. Referencias [1] Suutari M. et al, J Microbiol Methods 51 (2002) 411. Referencias [1] Suutari M. et al, J Microbiol Methods 51 (2002) 411. Referencias [1] Suutari M. et al, J Microbiol Methods 51 (2002) 411. (1). En estudios de actividad de Streptomyces sp. M7 (SM7) realizados por impedancimetría, se encontró que la Asp se comporta como un interferente ya que se observaron respuestas similares para cultivos en medio mínimo líquido (MM) en presencia y en ausencia de la fuente de C. El objetivo de este estudio es dilucidar si la SM7 efectivamente consume Asp tanto como fuente de N como de C. La determinación de Asp se efectuó amperométricamente utilizando electrodos compósitos de nanotubos de carbono modificados con micropartículas de cobre. La principal ventaja que presenta este sensor es la cuantificación de aminoácidos independientemente de su electroactividad y sin necesidad de derivatización previa(2). Se realizaron cultivos de distintas concentraciones iniciales de SM7 en MM con Asp 3,33 mM en presencia y ausencia de Glu a 30°C sin agitación. Las muestras se tomaron cada 24h durante 9 días, se centrifugaron y los sobrenadantes se conservaron a -18oC hasta el momento de la medición. La concentración de Glu residual se midió por método de Trinder(3). Para la cuantifiación de Asp residual se empleó amperometría con transporte convectivo controlado, aplicando 0,0V (vs. Ag/ AgCl/ NaCl 3 M) como potencial de trabajo y evaluando los cambios en corriente ante el agregado del sobrenadante. La concentración de Asp residual se determinó a partir de calibrados obtenidos mediante adiciones sucesivas de Asp 5,0 x 10-7 M, preparada en MM, encontrándose una alta estabilidad y reproducibilidad. La sensibilidad que presentó el sensor fue de (8,24 ± 2,10) x10-6 AM-1, similar a la obtenida para soluciones de Asp preparadas en ?buffer? fosfato 0,050 M pH 7,40. Más del (90 ± 10) % de la Asp se consumió dentro de las 72h para todas las concentraciones bacterianas estudiadas. Sin embargo, el consumo del  aminoácido en presencia de Glu es despreciable (menor al 10%) durante los 9 días. La glucosa se consumió en 7 días, en acuerdo con experimentos anteriores(4). Los resultados permiten concluir que la bacteria consume el aminoácido como fuente de N y de C. En consecuencia, para evaluar la actividad de la SM7 por impedancimetría se debería reemplazar la Asp por otra fuente de N. Referencias [1] Suutari M. et al, J Microbiol Methods 51 (2002) 411. [1] Suutari M. et al, J Microbiol Methods 51 (2002) 411. [2] Luque G.L. et al., Talanta 71 (2007) 1282. [3] Trinder P., J Clin Pathol 22 (1969) 246. [4] López Rodriguez M.L. et al., 6to Congreso Iberoamericano sobre Sensores, IBERSENSOR 2008, Sao Paulo, Brasil. Brasil. Brasil. [4] López Rodriguez M.L. et al., 6to Congreso Iberoamericano sobre Sensores, IBERSENSOR 2008, Sao Paulo, Brasil. Brasil. Brasil. [4] López Rodriguez M.L. et al., 6to Congreso Iberoamericano sobre Sensores, IBERSENSOR 2008, Sao Paulo, Brasil. Brasil. Brasil. [4] López Rodriguez M.L. et al., 6to Congreso Iberoamericano sobre Sensores, IBERSENSOR 2008, Sao Paulo, Brasil. Brasil. Brasil. Brasil.