VALIDACIÓN DE 11 TÉCNICAS DE PCR EN TIEMPO REAL PARA LA RÁPIDA DETECCIÓN DE BACTERIAS PATÓGENAS CAUSANTES DE DIARREA INFANTIL

LONDERO A, GALLI L, BRUSA V, COSTA M, GOLIJOW C, GUTKIND G, GONZALEZ E, LEOTTA G

Rosario

Congreso; XXIII Congreso Latinoamericano de Microbiología. XIV Congreso Argentino de Microbiología; 2016

AAM y ALAM

Las  diarreas  bacterianas  ocasionan  morbilidad  y  mortalidad  en  todo  el  mundo,  particularmente  en  países  en  desarrollo.  Los  métodos convencionales  de  aislamiento  de  estas  bacterias  continúan  siendo  la  forma  de  diagnóstico  más  utilizada  en  los  laboratorios  clínicos,  aun cuando  su  tiempo  de  procesamiento  atenta  contra  el  establecimiento  de  estrategias  de  soporte  (paciente)  y  de  control  (diseminación).  El objetivo  de  este  trabajo  fue  validar  11  reacciones  de  PCR  en  tiempo  real  para  la  rápida  detección  de  10  bacterias  patógenas  causantes  de diarrea infantil. Se evaluaron  primers  para la  detección de genes específicos de  Salmonella  spp.  (ttR), Shigella  spp.  (ipaH), Escherichia  coli enteropatogénico (eae), E. coli enterotoxigénico (eltA), E. coli productor de toxina Shiga (stx1 y stx2), E. coli O157:H7 (wzxO157), Cronobacter sakazakii (ompA), Campylobacter  termotolerante  (cadF),  Vibrio  cholerae  (toxR)  y Clostridium  difficile  (tcdB)  mediante  PCR  en  tiempo  real  utilizando  sondas TaqMan. Para cada PCR se determinaron los siguientes parámetros utilizando cultivos bacterianos puros: a) Rango de trabajo (límite de detección y límite de corte) con 1 cepa en concentaciones de 10 a 105 UFC/reacción, b) Inclusividad con 10 cepas positivas en la concentración correspondiente al límite de corte, c) Exclusividad con 9 cepas negativas en concentración 106 UFC/reacción y d) Robustez con 5 cepas positivas y 5 cepas negativas en concentración 106 UFC/reacción, modificándose las siguientes variables: día de ensayo, equipo y lugar de realización del ensayo. Se empleó el  termociclador  ABI  StepOne  Plus  de  Applied  Biosystems.  El  volumen  final  de  la mezcla  de  reacción  fue  de  25  µL  conteniendo:  12,5  µL  de master mix PB‐L (Productos Bio‐Lógicos, Argentina), 0,4 µM de cada primer, 0,2 µM de cada sonda marcadas con el fluoróforo FAM y 5 µL del extracto de ADN. El perfil térmico utilizado fue el siguiente: desnaturalización a 95°C por 10 min, 40 ciclos de amplificación a 95°C por 15 seg y a 59°C por 1 min. El límite de detección fue, para todas las reacciones, menor a 100 UFC/reacción y el límite de corte fue 100 o 1000 UFC/reacción según el gen target. La inclusividad fue de 100% para todas las reacciones excepto aquellas para Campylobacter y Clostridium que detectaron el 90% de las cepas y para Cronobacter cuya detección fue del 80% de las cepas. La exclusividad fue del 100% en todos los casos y la robustez fue óptima al modificar las diferentes variables mencionadas anteriormente. Es necesario realizar una validación con muestras de materia fecal contaminadas experimentalmente. Las  PCR  validadas  son  una  alternativa  rápida  y  sensible  para  la  detección  de  10  bacterias  patógenas,  cuya  aplicación  podría  contribuir  a disminuir el tiempo de diagnóstico clínico de diarreas bacterianas y mejorar la vigilancia epidemiológica.