Detección de endotoxinas en la elaboración de liposomas mediante ensayo de lisado de amebocito de limulus (LAL)

MAGALI E. RIDANO; FEDERICO MARGARÍA; MAXIMILIANO VAZQUEZ; GUSTAVO BONACCI; ISMAEL D. BIANCO; KIYOMI MIZUTAMARI

Congreso; 1er Congreso Nacional de Ciencia Reguladora ANMAT; 2019

La aplicación de la nanotecnología ha permitido vehiculizar principiosactivos (PA) hidrofóbicos, mejorando su biodisponibilidad e inclusodisminuyendo su toxicidad. Actualmente, entre las nanoformulacionesde PA, los liposomas son las más comunes en el mercado. Estos sonadministrados por vía parenteral, por lo cual el límite de endotoxinasen los mismos está regulado. Por otro lado, las endotoxinas podríaninteraccionar con los liposomas y/o sus componentes debido a sunaturaleza anfipática. En este trabajo, se evaluó la detección deendotoxinas durante la elaboración de liposomas conteniendodoxorrubicina, mediante el ensayo Lisado de amebocito de limulus(LAL). Se elaboraron liposomas [colesterol (Col) : diestearoilfosfoetanolamina-metoxipolietilen glicol 2000 (PE) : fosfatidil colinahidrogenada de soja (PC); (38:7:55 mol)] de ~100 nm determinado através de dispersión dinámica de luz (DLS), mediante ciclos deultrasonido - vortex, en presencia de endotoxina estándar de control(EEC) en la etapa de solubilización de los lípidos. Se determinaron lasEEC mediante el ensayo LAL cromogénico de punto final en estosliposomas sin doxorrubicina; como así también en el producto final,liposomas comerciales conteniendo doxorrubicina. Primeramente, seobservó que EEC añadidas al producto final, son detectadas; mientrasque añadidas en la etapa de solubilización de los lípidos, no sondetectadas; incluso solubilizando los liposomas con 0,25 - 0,5% deldetergente C12E10. Además, se observó que EEC agregadas a lasmuestras de cada uno de los lípidos en agua, son detectadas. Sinembargo, si dichos lípidos son solubilizados con EEC en isopropanol,secados por vacío y finalmente resuspendidos en agua, las EEC sondetectadas solo en las muestras de PE y PC. Aunque, si se preparanmuestras de Col, junto con PE o PC en una relación molar 40:60 o10:90 [Col:PE/PC], son detectadas. No obstante, si bien es posibleobservar la reacción de EEC con LAL, tanto la muestra Col:PE (40:60)como todas aquellas conteniendo PC, interfieren en la medición deabsorbancia (altas absorbancias iniciales). Asimismo, se observó queen presencia de PC, las EEC reaccionan con una cinética diferenterespecto a EEC en agua. Estos resultados indican que elprocedimiento usado en medicamentos tradicionales para el ensayoLAL, podría no ser suficiente para la detección confiable deendotoxinas en nanoformulados liposomales. Consideracionesparticulares deberían ser establecidas caso por caso.