Identificación de mutaciones y genes de fusión en pacientes argentinos con leucemia linfoblástica aguda pediátrica

RUIZ, MARÍA SOL; ABBATE, MERCEDES; RICCHERI, CECILIA; VAZQUEZ, ELBA; COTIGNOLA, JAVIER

Mar del Plata

Congreso; XXV Congreso Argentino de Hematología; 2021

Sociedad Argentina de Hematología

Introducción: Los pacientes pediátricos diagnosticados con leucemia linfoblástica aguda (LLA) son estratificados en grupos de riesgo basados en criterios bioquímicos, citogenéticos, moleculares y de respuesta al tratamiento. Aunque se han logrado grandes avances en la sobrevida global de los pacientes, en todos los grupos de riesgo se presentan pacientes que recaen y/o fallecen. La identificación de nuevos biomarcadores, como son las variantes de nucleótido único (SNVs) e inserciones/deleciones pequeñas (InDels) de relevancia biológica y clínica podría contribuir a mejorar la estratificación inicial de los pacientes.Objetivos: Identificar variantes genómicas a través de secuenciación del transcriptoma (RNA-seq) en muestras de médula ósea al diagnóstico de pacientes pediátricos argentinos con LLA, y evaluar la relación entre éstas y parámetros de relevancia clínica al diagnóstico y durante el tratamiento.Materiales y métodos: Se secuenció el transcriptoma de 37 muestras de médula ósea al diagnóstico por RNA-seq (HiSeq 2500, Illumina, paired-end). Se realizó una búsqueda de variantes por métodos bioinformáticos en un listado de genes candidatos. Se seleccionaron 114 genes para la búsqueda de SNVs/InDels y 79 genes de fusión, previamente reportados en bibliografía. Las variantes detectadas fueron sometidas a diversos filtros según: 1) número de lecturas y frecuencia alélica; 2) frecuencia en bases de datos de población sana (1000 genomes); 3) categorización en bases de datos de variantes clínicas germinales (ClinVar); 4) asociación previa a algún fenotipo; y 5) predicción de patogenicidad (VariantEffect Predictor, Ensembl). La confirmación de las variantes fue realizada por secuenciación de Sanger a partir de productos de RT-PCR.Resultados: Inicialmente se detectaron 9594 SNVs/InDels/genes de fusión en 37 pacientes. Luego del proceso de filtrado y anotación de variantes, se obtuvieron 71 SNVs/InDels en 31 pacientes y 3 genes de fusión en 5 pacientes. Aplicamos un segundo filtro para identificar las variantes más probablemente asociadas a la progresión de la enfermedad, basado en la clasificación en oncogénicas y probablemente oncogénicas (OncoKB), o descriptas en LLA en COSMIC. Identificamos 17 SNVs/InDels distribuidas en 13 genes en 12 pacientes (35% de las muestras). De estos 12 pacientes, el 50% presentó más de una variante al diagnóstico. Algunas de las variantes se encontraron en homo/hemicigosis, sugiriendo pérdida de heterocigocidad en los respectivos loci. Los pacientes con alguna de las 17 SNVs/Indels seleccionadas presentaron un mayor cociente de riesgo para la recaída que aquellos sin alguna de estas variantes (risk ratio = 1,71; IC = 1,06 – 2,76). La sobrevida libre de recaída fue menor para el grupo de pacientes con las variantes seleccionadas (Log-rank p-val = 0,006). Dado que se trata de un estudio prospectivo, es necesario aumentar el tiempo de seguimiento de los pacientes para confirmar esta tendencia. Se detectó el gen de fusión P2RY8-CRLF2 por RNA-seq en 1 caso, el cual fue confirmado por RT-PCR seguido de secuenciación de Sanger. Se evaluaron 20 muestras adicionales de médula ósea al diagnóstico por RT-PCR para la detección de P2RY8-CRLF2, y se detectó el transcripto de fusión en 3 casos.Conclusiones: La identificación de mutaciones de tipo SNVs/InDels al diagnóstico podría contribuir a la detección de temprana de pacientes con mayor riesgo de recaída; la confirmación de estas observaciones requiere de un mayor tiempo de seguimiento. Dada la heterogeneidad genética de la LLA al diagnóstico, también se requiere de un mayor número de pacientes. El análisis bioinformático aplicado resultó preciso para la detección de variantes de tipo SNVs/InDels y genes de fusión en datos de RNA-seq, ampliando la utilidad de este tipo de estudios más allá de los análisis clásicos de expresión génica diferencial.