Cuantificación de la expresión transgénica mediada por vectores adenovirales en el nucleo rojo de la rata

MOREL, GR; PORTIANSKY, EL; ZUCCOLILLI, GO; GOYA, RG.

Villa Giardino. Córdoba.

Taller; 7mo Taller Argentino de neurociencias; 2005

Con el objetivo general de poner a punto la metodología morfométrica necesaria para cuantificar la expresión de transgenes terapéuticos en modelos animales de neurodegeneración senil, se determinó la expresión transgénica de dos vectores adenovirales en el núcleo rojo (NR) de la rata. Estos vectores fueron: 1) Ad.nls.b-gal, portador del gen de la b-galactosidasa de E. coli; 2) RAd(GFP-TK)fus, portador de un gen para una proteína de fusión entre la green fluorescent protein (EGFP) y la timidina kinasa herpética (TK). Estudios preliminares habían demostrado que la expresión transgénica mediada por vectores adenovirales es particularmente homogénea en el NR, razón por la cual se eligió esta estructura para el presente trabajo. Debe mencionarse, no obstante, que la inyección estereotáxica de los transgenes aumenta la densidad de expresión del marcador en el trayecto de la aguja, la que debe ser tenida en cuenta a la hora de realizar la cuantificación de la distribución total de la expresión. Para evitar este inconveniente, se inyectaron los vectores virales en coordenadas vecinas al NR (AP=4,7; ML=1,2; DV=7mm; Paxinos, 1998). Ratas macho Sprague-Dawley de 3-4 meses de edad se perfundieron por vía intracardíaca con PBS-4% paraformaldehído. Se obtuvieron secciones coronales de 40µm que se incubaron con el reactivo X-gal para revelar la actividad de la b-gal. Las imágenes del NR se capturaron con una cámara digital DP70 (Olympus) anexada a un microscopio Olympus BX51 para microscopía de luz y fluorescencia, mediante un objetivo de 20X. La imágenes analizadas mediante el software Image Pro Plus v5.0 (Media Cybernetics) tuvieron una profundidad de pixel de 24 bits, RGB y formato TIFF. Los límites del NR fueron delineados manualmente y dentro de esta región de interés solo se contaron las células reactivas para X-gal o fluorescentes, según correspondiese, cuyas áreas superaran los 100 µm2 y mostraran una expresión claramente visible. Se estudiaron y compararon los perfiles de expresión in vivo de b-gal y EGFP en estudios de corto plazo (2 días post inyección - PI), así como estudios de expresión de mediano plazo (42 y 52 días PI) del gen de b-gal. Se observó que la expresión de la b-gal se mantiene con los mismos niveles en el NR a los 2, 42 y 52 días PI con una eficiencia de transducción de alrededor del 80% en estas neuronas. La expresión de la EGFP (2 días PI) mostró el mismo nivel de expresión que la b-gal. Se concluye que ambos transgenes muestran un patrón similar de expresión en el NR a corto plazo. En términos cuantitativos, la expresión adenoviral de b-gal se mantiene a niveles significativos, al menos durante 52 días PI, lo cual indica que nuestros vectores adenovirales son apropiados para implementar estrategias experimentales de mediano plazo en el NR.