. Evaluación del clivaje de la citoqueratina 18 presente en células de cultivo infectadas con Herpesvirus equino 1 (EHV-1) e inducidas a la muerte por apoptosis

SCROCHI MR; ZANUZZI CN; FUENTEALBA NA; MUGLIA CI; GIMENO EJ; BARBEITO CG; PORTIANSKY EL; GALOSI CM

Vaquerias

Jornada; Reunión de Virología; 2012

Asociación Argentina de Microbiología

El EHV-1 es un agente infeccioso que produce signos respiratorios, nerviosos, muerte embrionaria, abortos y síndrome neonatal en equinos. La respuesta inmune a la infección es de corta duración y, al igual que el resto de los herpesvirus, el EHV-1 desarrolla distintos mecanismos para evadirla. Entre otros, el virus evita que las células infectadas mueran por apoptosis, lo que le permite subsistir y replicarse dentro de ellas. La citoqueratina 18 es una de las proteínas citoplasmáticas blanco de las caspasas efectoras cuando se desencadena el proceso de apoptosis. La citoqueratina 18 es una de las proteínas citoplasmáticas blanco de las caspasas efectoras cuando se desencadena el proceso de apoptosis. Hasta el momento, no se han determinado los mecanismos por los cuales el EHV-1 interfiere con la apoptosis y sólo un trabajo demuestra la capacidad de inhibir este proceso en cultivos neuronales. El objetivo del presente trabajo fue determinar el índice de clivaje de la citoqueratina 18 presente en células de cultivo infectadas con el EHV-1, en diferentes tiempo posinfección (pi), mediante técnicas de inmunofluorescencia. Se utilizaron células MDBK desarrolladas con MEM-10% SFB durante 48 hs. La monocapa fue infectada con EHV-1 (MOI10) e incubadas con MEM-1% SFB. A las 3, 6, 9, 12, 15 y 18 hs pi se indujo la apoptosis mediante el agregado de sorbitol 1M (concentración previamente determinada mediante medición de fragmentación de ADN en gel de agarosa) durante 1 h. Las células fueron reincubadas durante una hora con MEM-1% SFB y posteriormente levantadas y fijadas con acetona fría. Para cada uno de los tiempos analizados se realizaron controles de infección-no inducción, de no infección-inducción y de no infección-no inducción. Las células se incubaron con los anticuerpos M30 CytoDEATH (Roche) y anti-ratón conjugado con el fluorocromo Alexa 488. Finalmente, las células fueron incubadas con DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol) para identificar los núcleos celulares. Las imágenes obtenidas a través de un microscopio confocal fueron cuantificadas mediante un analizador de imágenes. El mayor porcentaje de apoptosis celular en los controles de no infección-no inducción, se observó a las 9 h, mientras que en el control infección-no inducción en este tiempo fue menor que en el control no infección-no inducción. Asimismo, este valor estuvo por debajo del observado en los controles de infección a las 15 y 18 h pi. En el control de no infección-inducción se observó un incremento gradual del porcentaje de apoptosis, aunque con valores menores que en los del control de infección. En las células infectadas e inducidas se detectó apoptosis a las 3 h pi, la que reapareció a las 12 h pi, incrementándose a las 18 h pi. Sin embargo, a las 9, 15 y 18 hs pi los porcentajes de apoptosis del grupo infección-inducción fueron menores que en los controles de infección, siendo el porcentaje más bajo el de las 9 hs. Podemos concluir que la infección por EHV-1 estaría retrasando la apoptosis de las células infectadas durante la primera etapa del ciclo de replicación viral (9 h pi) y, en menor medida hacia el final del mismo (18 h), lo que podría entonces estar relacionado a la transcripción viral de los genes tempranos.