¿Es necesario estandarizar protocolos, previo a la realización de técnicas de inmunofluorescencia?

NISHIDA F; ZANUZZI, C; PORTIANSKY EL

Congreso; XIII Congreso de Ciencias Morfológicas de La Plata y 10mas Jornadas de Eduación; 2011

La inmunofluorescencia es una técnica utilizada de rutina para la determinación de diferentes parámetros biológicos. Presenta ciertas ventajas sobre la inmunohistoquímica tradicional ya que permite realizar: análisis cuantitativos de intensidad; dobles o triples marcaciones simultáneas; utilizar menor cantidad de reactivos y menor tiempo de ejecución. Con el fin de mejorar la señal fluorescente obtenida a partir de cortes histológicos de médula espinal montados en portaobjetos gelatinizados, se evaluaron dos parámetros: 1. Evaluación del tiempo y modo de conservación de tejido fresco. Para ello se utilizaron cortes gruesos (20 μm) de médula espinal de ratas Sprague Dawley. Se evaluaron tres formas de conservación y tiempos del material: a. montado en vidrio y mantenido una semana a 4°C; b. conservado en PBS a 4°C durante un mes y c. conservado un mes en solución criopreservante a -20°C. 2. El efecto de la permeabilidad celular a los anticuerpos. Para ello se estableció: a. anticuerpos diluidos en BSA 0,1% y lavados con PBS; b. anticuerpos diluidos en BSA 0,1 % + Tween 0,5%; c. utilizando PBS + Tween 0,5% durante los lavados. Se utilizaron anticuerpos monoclonales anti-Vimentina y policlonales anti-GFAP. Como fluoróforos se utilizaron Alexa 488 y Alexa 555. Los cortes se montaron con Fluoromount y se observaron con microscopio confocal. Los cortes mantenidos en solución criopreservante y los protocolos en los que se incluyó Tween en el lavado, mostraron las mayores intensidades de tinción fluorescente. Estos resultados demuestran la necesidad de estandarizar los protocolos en las técnicas de inmunofluorescencia.Tween 0,5%; c. utilizando PBS + Tween 0,5% durante los lavados. Se utilizaron anticuerpos monoclonales anti-Vimentina y policlonales anti-GFAP. Como fluoróforos se utilizaron Alexa 488 y Alexa 555. Los cortes se montaron con Fluoromount y se observaron con microscopio confocal. Los cortes mantenidos en solución criopreservante y los protocolos en los que se incluyó Tween en el lavado, mostraron las mayores intensidades de tinción fluorescente. Estos resultados demuestran la necesidad de estandarizar los protocolos en las técnicas de inmunofluorescencia.