BÚSQUEDA DE NUEVAS PROTEÍNAS INVOLUCRADAS EN LA OXIDACIÓN DE MANGANESO (II)

AINELEN PIAZZA; CIANCIO, L.; GOTTIG, N.; JORGELINA OTTADO

Buenos Aires

Congreso; III Congreso Argentino de Microbiología Agrícola y Ambiental; 2015

Las bacterias oxidantes de Manganeso (Mn) son filogenéticamente diversas y generalmente seencuentran en ambientes versátiles tales como el suelo, las aguas naturales y sedimentos. Hasta elmomento se han identificado dos tipos de enzimas con capacidad de oxidar Mn (II): las enzimasllamadas Multicobre oxidasas (MCO), que son una familia de proteínas que unen cobre y que tienenla capacidad de oxidar distintos sustratos, y las Hemo-peroxidasas de unión a calcio. Sin embargo,no se han realizado estudios exhaustivos para identificar proteínas involucradas en los procesos debiooxidación, transporte y metabolismo de este metal. Asimismo, existen pocos estudios de losmecanismos moleculares utilizados en estos procesos por bacterias aisladas de zonas con altaconcentración de Mn.En estudios previos realizados en nuestro laboratorio se seleccionó y aisló una bacteria oxidante deMn a partir de muestras ambientales, identificada como Pseudomonas resinovorans. El géneroPseudomonas representa un sistema modelo, ideal para el estudio de la fisiología y mecanismo deoxidación de Mn (II), debido a la facilidad de crecimiento y manipulación en condiciones estándarde laboratorio. En este trabajo se propone identificar nuevas proteínas involucradas en la oxidaciónde Mn (II), a partir del estudio de dicho aislamiento bacteriano.Para ello, se realizaron ensayos que permiten verificar actividad oxidante de Mn por PAGE nativo,?ensayo de oxidación in gel? in situ. Se sembró la fracción de proteínas solubles intracelulares ysolubles secretadas de la cepa de interés en geles de poliacrilamida 8%. Luego de la electroforesis,los geles fueron incubados por 30 minutos en un buffer (pH 7.5; 0.5% Triton X-100,10% [v/v]glicerol) y posteriormente en HEPES 10 mM (pH 7.5; 200 μM MnCl2 y CuSO4). El proceso deoxidación pudo seguirse visualmente mediante la aparición de bandas de óxidos de Mn de colormarrón en el gel, las cuales aparecen usualmente luego de 24 h de incubación a 37°C. Posteriormente,para verificar que las bandas observadas efectivamente correspondían a óxidos de Mn, se incubó elgel con Leucoberbelina, un compuesto que en presencia de Mn (III o IV) se oxida, produciendo uncolor azul.Se pudo detectar una banda de oxidación de Mn en la fracción de proteínas solubles secretadas de labacteria analizada. El análisis posterior de la banda por nanoHPLC-ESI-Orbitrap permitirá laidentificación de la proteína responsable de la oxidación.Por otro lado, se puso a punto un ensayo colorimétrico con leucoberbelina, que permite cuantificar lacapacidad de oxidación de Mn (II).Este trabajo contribuirá al entendimiento del proceso de oxidación de Mn (II) en Pseudomonasresinovorans y además este estudio podrá extrapolarse a otro tipo de bacterias.