Destellos (sparks) y ondas de Ca2+ en la isquemia y reperfusión en el corazón intacto. Su relación con la sobrecarga de Ca2+ y las arritmias de reperfusión.

VALVERDE CA

Mar Del Plata

Congreso; LIX Reunión Anual - Sociedad Argentina de Investigación Clínica; 2014

SAIC-SAI

Introducción: El ciclado anormal del calcio (Ca2+) cumple un papel clave en la disfunción cardíaca, particularmente en la condición patológica de isquemia y reperfusión (I/R). Cuando el corazón es sometido a una isquemia se produce un aumento en el Ca2+ citosólico (Valverde et al., JMCC 2006). Hemos descripto que este aumento se acompaña de un aumento en el contenido de Ca2+ del retículo sarcoplasmático (RS) (Valverde et al., Card Res 2010). La restauración del flujo coronario (reperfusión), genera un aumento transitorio y abrupto en el Ca2+ citosólico asociado a arritmias de reperfusión (Said et al., JMCC 2011). Aunque hay muchos estudios relacionados a la disfunción cardíaca en la I/R y a intervenciones que protegen al miocardio en dicho escenario, se conoce muy poco acerca de la dinámica de los eventos subcelulares involucrados en el incremento del Ca2+ durante la I/R a nivel del corazón entero, incremento que como se mencionó, es un factor esencial en las diferentes alteraciones provocadas por la I/R.El ciclado de Ca2+ normal entre el RS y el citosol, que ocurre durante las fases de contracción y relajación cardíacas, está regulado por fosforilaciones de proteínas mediadas por quinasas entre las que se encuentra la quinasa dependiente de Ca2+ y calmodulina (CaMKII). En trabajos previos de nuestro laboratorio demostramos que la CaMKII se activa al comienzo de la reperfusión y que las fosforilaciones mediadas por ella cumplen un rol dual en la I/R. Por ejemplo, poseen un rol protector, atenuando la sobrecarga de Ca2+ en la I/R reversible, por aumento del secuestro de Ca2+, pero a la vez son principales responsables de las arritmias de reperfusión, por aumento de la pérdida de Ca2+ por el RS. El Ca2+ que se pierde, es extruido a través de la membrana plasmática, por medio del intercambiador sodio/calcio (Na+/Ca2+, NCX), intercambiándose por Na+, despolarizando así la membrana (DAD, del inglés delayed after depolarizations) y aumentando así la probabilidad de ritmos ectópicos. Este mecanismo explica el mayor porcentaje de las arritmias de reperfusión (Said et al., JMCC 2011). A pesar de estos hallazgos, se desconoce cuál es el substrato subcelular que determina el aumento del Ca2+ citosólico en la isquemia y al comienzo de la reperfusión, cuál el de las arritmias en la reperfusión y si la CaMKII está involucrada en estas alteraciones subcelulares.El objetivo de este trabajo fue evaluar las siguientes hipótesis: 1. El sustrato principal del aumento del Ca2+ diastólico que se describe en la isquemia, está constituido por un aumento en la pérdida de Ca2+ por el RS, en forma de sparks de Ca2+. 2. El aumento del Ca2+ diastólico durante la reperfusión está mediado por pérdidas de Ca2+ del RS que se propagan por el miocito, convirtiéndose en ondas de Ca2+ proarritmogénicas (waves). 3. El aumento de las sparks de Ca2+ en la isquemia y de las ondas proarritmogénicas, en la reperfusión, si éste ocurre, está mediado por una mayor actividad de la CaMKII.Materiales y métodos: Las ondas y sparks de Ca2+ históricamente han sido estudiados en células cardíacas aisladas (cardiomiocitos), y sólo unos pocos trabajos han estudiado ondas de Ca2+ en el corazón. Hasta el momento, no hay estudios que hayan investigado sparks de Ca2+ y sus características, en el corazón intacto y se desconoce totalmente la dinámica del Ca2+ intracelular a nivel subcelular, en la I/R.En el presente trabajo utilizamos la moderna, valiosa y conocida técnica de microscopía confocal, pero aplicada a un preparado entero como el corazón aislado de ratón perfundido de acuerdo a la técnica de Langendorff, para el estudio de sparks y ondas de Ca2+ (véase en la Figura a continuación ejemplos de los registros obtenidos). Los corazones se cargaron con un indicador fluorescente sensible al Ca2+ (Fluo-4) y luego de la estabilización fueron sometidos a un protocolo de isquemia global normotérmica (32ºC) durante 12 min, seguida por restablecimiento del flujo coronario durante 30 min. Durante todo el protocolo se evaluaron las sparks y ondas de Ca2+ en el epicardio del corazón intacto. Para estudiar la relación de CaMKII con los eventos subcelulares estudiados, un grupo de corazones se sometió al mismo protocolo descrito, pero en presencia de 2,5 µM de KN-93, un inhibidor específico de CaMKII. El KN-93 se administró 10 min antes del corte de flujo coronario, y se mantuvo durante los 10 primeros min de la reperfusión.Resultados: Durante el período de isquemia en el corazón intacto, la frecuencia de las sparks aumentó significativamente respecto al período preisquémico (2,06±0,35 vs. 1,13±0,25 sparks/seg/100µm, n=29/41, 7 corazones). La reperfusión cambió significativamente la cinética de los sparks de Ca2+, prolongando el tiempo de aumento de fluorescencia de las mismas, y disminuyó la frecuencia de estos eventos subcelulares espontáneos (véase siguiente Figura). Sin embargo, la frecuencia de las ondas de Ca2+ aumentó significativamente respecto a la frecuencia observada durante el período isquémico (0,50±0.0.09 vs. 0,26±0.04 ondas/seg/100µm, n=43/57, 7 corazones) (Fig xx). La perfusión de los corazones con el inhibidor de CaMKII, KN-93, disminuyó significativamente el aumento en la frecuencia de sparks durante la isquemia y la aparición de ondas de Ca2+ durante la reperfusión (véase Figura, barras naranja).Conclusiones: Los resultados muestran por primera vez las características morfológicas de las liberaciones espontáneas de Ca2+ denominadas destellos o sparks en el corazón intacto perfundido y proveen evidencia de que las mismas aumentan durante la isquemia transformándose a ondas de Ca2+ en la reperfusión y constituyendo así el sustrato necesario para las arritmias de reperfusión. Los resultados indican además que la inhibición de CaMKII previene el ciclado anómalo del Ca2+ que origina la sobrecarga de Ca2+ y las ondas arritmogénicas en la I/R y validan y enfatizan el posible uso de los inhibidores de esta quinasa como una futura herramienta terapéutica en el daño producido por la isquemia y reperfusión del tejido cardíaco.