Descripción molecular de la vía de internalización del Virus de la Bursitis Infecciosa Aviar

GIMÉNEZ, M.C.; RODRÍGUEZ, J.F; COLOMBO, M.I.; DELGUI, L.R.

Mendoza

Jornada; VI Jornadas de Investigación de la Universidad Juan Agustín Maza; 2014

Universidad Juan Agustín Maza

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE LA VÍA ENDOCITICA INVOLUCRADA EN LA INTERNALIZACIÓN DEL VIRUS DE LA BURSITIS INFECCIOSA AVIARBioq. M.C. Giménez1;Dr.J.F. Rodríguez3;Dra.M.I. Colombo1,2;Dra.L.R. Delgui1,2Universidad Juan Agustín Maza1IHEM, UNCuyo-CONICET, Mendoza, Argentina2 CNB-CSIC, España3.Correo electrónico de contacto: ldelgui@fcm.uncu.edu.arEl Virus de la Bursitis Infecciosa Aviar (IBDV) es miembro integrante de un grupo de virus desnudos que conforman la familia Birnaviridae. Estructuralmente es un virus icosaédrico, cuyo genoma está constituido por dos segmentos de ARN de cadena doble (dsRNA). Cada partícula viral está formada por una cápside construida a partir de la proteína VP2. En el interior de la cápside se encuentra el complejo ribonucleoproteico formado por el dsRNA recubierto por la proteína VP3 y asociado covalentemente a RNA polimerasa dependiente de RNA, VP1. IBDV es un importante patógeno aviar que infecta individuos jóvenes de gallina doméstica (Gallus gallus) y es el agente etiológico de una enfermedad inmunosupresora grave conocida como Bursitis Infecciosa Aviar o Enfermedad de Gumboro, responsable de grandes pérdidas económicas en la industria avícola. En condiciones naturales, la trasmisión del virus se produce por vía oral. La replicación inicial del virus ocurre en macrófagos y linfocitos B presentes en el tracto gastrointestinal. Posteriormente, el virus alcanza por vía sanguínea la bolsa de Fabricio, órgano que proporciona condiciones óptimas para el virus, donde se multiplica rápida y masivamente produciendo la perdida de la población linfocitaria y la consiguiente inmunosupresión.El ciclo de replicación de un virus implica un conjunto complejo de interacciones entre la maquinaria de la célula hospedadora y componentes virales para dar lugar a la producción de una nueva progenie viral. El primer paso en el ciclo de infección de un virus es su ingreso a la célula hospedadora, evento que para una gran cantidad de agentes virales ocurre empleando la vía endocítica de las células hospedadoras. Las células eucariotas llevan a cabo diferentes tipos de endocitosis que varían tanto en sus características moleculares como en el tipo de partícula endocitada. La macropinocitosis es un tipo especial de endocitosis que ocurre cuando la membrana plasmática emite pseudópodos que engloban material extracitoplamástico en grandes vesículas denominadas macropinosomas. En los últimos años, diversos estudios han demostrado que un gran número de agentes patógenos virales emplean la macropinocitosis para su internalización en la célula hospedadora.El mecanismo de internalización de IBDV es uno de los aspectos del ciclo de vida de este patógeno que aún no había sido caracterizado y por ello ha constituido uno de los objetos de estudio de nuestro grupo de investigación. Así, hemos caracterizado el mecanismo molecular que emplea IBDV mediante el estudio sistemático de los componentes moleculares involucrados en los diferentes tipos de endocitosis. En primer lugar estudiamos los componentes de la membrana celular involucrados en la internalización del virus. Clatrina y caveolina son proteínas que cubren los endosomas nacientes de la membrana plasmática, que caracterizan las vías endocíticas clatrina- y caveolina-dependiente. Nuestros resultados indican que dichas vías no participarían en la internalización del virus. También estudiamos el papel del colesterol presente en la membrana, el cual está asociado a la vía endocítica mediada por caveolina y encontramos que el colesterol tampoco es requerido para la entrada de IBDV. A su vez, la entrada de IBDV también fue independiente de dinamina, proteína responsable de escindir los endosomas recién formados de la membrana plasmática. Estos resultados nos permitieron enfocar nuestros estudios hacia la vía macropinocítica como probable mediadora de la entrada del virus a la célula hospedadora. Es sabido que el transcurso normal de ésta vía es dependiente de la integridad del citoesqueleto de actina de la célula. Por lo tanto, analizamos el papel de la actina en la entrada del virus y observamos que cuando desorganizamos la red de actina en las células, la infección por el virus resulta fuertemente afectada. Luego, abordamos el estudio del transportador NHE-1 que participa en el intercambio de Na+ y H+, una proteína integral de membrana cuya funcionalidad está fuertemente asociada a la correcta formación de los macropinosomas. Para ello utilizamos inhibidores específicos del transportador y demostramos que su actividad resulta fundamental para una infección productiva de IBDV. Además, ensayos realizados con Dextrano, una molécula que ingresa a las células por medio de macropinosomas, demostraron que el virus, luego de su internalización, se localiza en los mismos compartimentos que dicha molécula, resultado que aportó sustento y reforzó los resultados anteriores que sugerían que el virus emplea la vía macropinocítica para ingresar a las células. Por último, realizamos un análisis morfológico de la entrada del virus para lo que utilizamos técnicas de microscopía electrónica. Estudiamos el proceso de internalización a diferentes tiempos post-infección, y observamos que luego de 60 minutos las partículas virales se encuentran en estructuras vesiculares de membrana simple y de gran tamaño, compatibles con estructuras de la vía macropinocítica. Además, como era esperable, pudimos observar que el proceso de internalización del virus se ve profundamente afectado cuando el citoesqueleto de actina es irrumpido por inhibidores de la polimerización de actina. Por último, decidimos estudiar el tipo de compartimentos por los cuales transita el virus luego de haber sido internalizado por la célula. Para ello analizamos el papel de las proteínas Rab5 y Rab7. Rab5 es una proteína que se localiza en vesículas endosomales tempranas, mientras que Rab7 se encuentra asociada a vesículas con características tardías. Los resultados obtenidos reflejaron que el virus, una vez internalizado en la célula hospedadora, se localiza en compartimentos tempranos de la vía endocítica, Rab5-positivos y que dicho tránsito depende de la funcionalidad de Rab5.El conjunto de los resultados obtenidos nos han posibilitado describir a la vía macropinocítica como el principal mecanismo de entrada que utiliza el virus para ser internalizado por la célula hospedadora. Además, hemos podido determinar que las partículas virales recientemente internalizadas se localizan en compartimentos endosomales tempranos de la vía endocítica, Rab5 positivos y que la actividad de ésta es fundamental para el progreso del ciclo replicativo del virus. Estos resultados son totalmente novedosos en el campo de los Birnavirus por lo que revisten una gran importancia tanto para los birnavirus como para el área de la virología en general.