Estudio de la interacción de la proteína VP3 de Birnavirus con membranas utilizando técnicas biofísicas-computacionales

SUHAIMAN, LAILA; GALASSI, VANESA VIVIANA; CHIARPOTTI, VANINA; DELGUI, LAURA RUTH; DEL PÓPOLO, MARIO GABRIEL

Virtual

Congreso; I Congreso Interuniversitario I+D+i Mendoza; 2021

Los Birnavirus replican su genoma utilizando los endosomas celulares como plataforma. En ellaboratorio de la Dra. Delgui, se ha identificado la prote na viral VP3 como responsable de la uni n delos componentes virales a las membranas endosomales y se ha descripto el partner de VP3 en losendosomas, que es el fosfatidilinositol 3‐fosfato (PI3P). Estos resultados constituyen la primerevidencia de que compartimentos membranosos como los endosomas son requeridos por los viruscon genoma compuesto por doble cadena de ARN para su replicaci n. Este trabajo busca generarnuevos conocimientos de la din mica de interacci n de VP3 con fosfoinos tidos, como el PI3P que esla especie predominante en endosomas tempranos. Para responder estos interrogantes proponemosun an lisis biof sico computacional mediante la aplicaci n del modelo de grano grueso (GG)MARTINI (MT), combinado con Teor a Molecular (TM), una t cnica derivada de la mec nicaestad stica y teor as de campo medio. En el modelo de mec nica molecular de GG, la estructuramolecular de los l pidos, agua y prote nas se simplifica por fusi n de part culas at micas,manteniendo una descripci n cuasiatom stica, para lograr una mayor eficiencia de c mputo.MARTINI ha sido parametrizado para describir adecuadamente las interacciones intermoleculares ensistemas biol gicos, y con  l se pueden simular sistemas con miles de componentes durante tiemposdel orden de los microsegundos. Hemos planteado los siguientes objetivos: Partiendo de la estructuracristalogr fica de VP3, lograr obtenerla en formato de GG, y mediante el uso de TM estimar laenerg tica de la interacci n de la prote na con membranas modelo. En primer lugar se model  laestructura cristalogr fica de VP3 (PDB ID 2R18) con GG. Cabe destacar que la condensaci natom stica efectuada en MT presenta falencias para preservar la estructura 2ria de prote nasglobulares a trav s de simulaciones de Din mica molecular (DM) extensas, por lo que es necesarioaplicar restricciones en las cadenas polipept dicas para preservar la estructura nativa, como laadici n de potenciales arm nicos entre granos no conectados por enlaces que tratan de preservar laestructura global de la prote na. Se efectu  una calibraci n de los par metros de las restricciones,probando dos modelos: Elastic Network y ElNeDyn, y se los compar  con los resultados en ausenciade restricciones. Elastic Network genera una red el stica simple utilizando como punto de partida lospar metros est ndares del campo de fuerza, mientras que ElNeDyn incorpora cambios en el campode fuerza de MT y por lo tanto se toma como un campo de fuerza en s  mismo. Tambi n permitecambiar los valores de constante de fuerza del potencial arm nico de la red el stica y el radio decorte para conectar granos de esqueleto pept dico, para adaptarlos al sistema con el que se est trabajando. A trav s del c mputo de la desviaci n cuadr tica media de las coordenadas del enlacepept dico respecto de la estructura cristalogr fica, en trayectorias de 50 ns efectuadas con los dosm todos y en ausencia de red el stica, se determin  que ElNeDyn era el modelo m s exitoso parapreservar la conformaci n 2ria y 3ria de las prote nas. Con esta misma estrategia, se calibraron lospar metros del m todo (constante de fuerza arm nica y radio de corte de la red el stica) con mejordesempe o. Se construyeron modelos de MT de fragmentos de VP3: i) THR92‐HIS220 monom rico( nico segmento cristalizado, PDB ID 2r18); ii) GLY83‐ASN222 monom rico (fragmento con que laDra. Delgui ha realizado experimentos); iii) GLY83‐ASN222 dimerizado; iv) extremo c‐term (CT)ARG223‐GLU258; v) GLY83‐GLU258. Efectuamos simulaciones de DM de 50‐100 ns en agua deMT, incluyendo restricciones el sticas  nicamente en el segmento THR92‐HIS220 que se encuentracristalizado. Recurrimos a la aplicaci n de TM para cuantificar la adsorci n de los constructos conmembranas que contienen l pidos ac dicos. Muestreamos distintas condiciones, como laconcentraci n de sal de la soluci n y la proporci n de l pido ani nico de la membrana. El punto fuertede este m todo es que considera el equilibrio  cido‐base de todas las especies titulables delsistema, como residuos ionizables de la prote na y grupos  cidos de la membrana .Las interaccionesincluidas son las electrost ticas y est ricas. Los efectos entr picos surgen a partir del muestreoconfiguracional y conformacional del ensamble de prote na obtenido a partir de DM que se introduceen el c lculo. El estado de protonaci n de los l pidos y de los amino cidos titulables, se asignadependiendo del potencial electrost tico local y sus contribuciones a la energ a libre del sistema. Lamembrana se modela como un diel ctrico con una densidad de grupos titulables. A trav s de laminimizaci n de un funcional de energ a libre de Hemholtz que contiene dichos par metros, seobtienen las densidades locales de prote na, a partir de las cuales se recupera el potencial de fuerzamedia (PMF) para la interacci n prote na-membrana. La TM eval a la interacci n de lasconfiguraciones incluidas, y les da peso estad stico seg n la energ a de la interacci n. A partir delc mputo del PMF observamos que la adsorci n de los segmentos de VP3 a la superficie de lamembrana est n gobernados por barreras de energ a libre que son sensibles a la concentraci n desales del sistema y la densidad de carga superficial. Las construcciones i, ii y iii no presentancontribuci n electrost tica favorable a la adsorci n, lo que es esperable al presentar una distribuci nde residuos cargados con cargas netas negativas: ‐6, ‐5 y ‐10 respectivamente. Sin embargo, elextremo CT (construcci n iv, de carga neta +5), mostr  una interacci n electrost tica favorable con lamembrana ani nica. Nuestros resultados indican que las interacciones electrost ticas, moduladaspor efectos entr picos proveen la fuerza que regula la cin tica de adsorci n de las prote nas a lamembrana. En el caso de VP3, se observa que la prote na presenta una uni n d bil con membranasani nicas, lo que concuerda con una interacci n transitoria. Esta asociaci n es impulsada por lainteracci n del p ptido CT con la interfaz cargada de la membrana. Nuestro objetivo principal paraeste trabajo es que las simulaciones computacionales asistan en la interpretaci n de los resultadosexperimentales que ser n aportados por el grupo de la Dra. Delgui