Caracterización de la autofagia y estudio del efecto de la infección por Cytomegalovirus humano en células renales epiteliales

LÓPEZ GIULIANI, ANA CAROLINA; DELGUI, LAURA R.

Virtual

Congreso; I Congreso Interuniversitario I+D+i Mendoza; 2021

Universidad Nacional de Cuyo

El Cytomegalovirus humano (HCMV) pertenece a la familia Herpesviridae y su nombre deriva del agrandamiento celular que produce cuando infecta las células. HCMV es un patógeno oportunista y la prevalencia de infección a nivel mundial por HCMV es alta, de hecho, se calcula que el 90% de la población es seropositiva para el virus. En individuos inmunocompetentes la infección primaria suele ser asintomática. Luego de superarse esta primer infección, el virus queda latente en monocitos y probablemente en otros tejidos pudiendo reactivarse como consecuencia de diversos estímulos.En pacientes inmunocomprometidos la infección por HCMV es una causa importante de mortalidad y morbilidad. Así, la infección por HCMV en pacientes con trasplante renal es una complicación habitual que suele aparecer durante el primer año post trasplante. El efecto de la infección es significativo para la supervivencia del paciente y del trasplante, pudiendo promover el desarrollo de infecciones oportunistas, trastornos linfoproliferativos o pérdida y rechazo del al injerto.Por otro lado, desde hace varios años se está estudiando la relación de la autofagia con HCMV. La vía autofágica es un proceso catabólico celular y altamente regulado, encargado de mantener la homeostasis y es uno de los mecanismos de defensa celular más antiguos que se conoce contra la invasión de patógenos. Recientes estudios en fibroblastos humanos demostraron que HCMV modula la autofagia durante la infección. De hecho, ocurren dos procesos antagónicos, durante las primeras etapas de la infección HCMV induce autofagia y en etapas posteriores el virus inhibe la autofagia. Como el trasplante renal es el que se lleva a cabo con mayor frecuencia, decidimos centrarnos en estudiar las infecciones renales causadas por HCMV ya que, no se conoce por completo la fisiopatología de la infección.El objetivo del presente trabajo ha sido caracterizar la inhibición de la autofagia y su papel en el agrandamiento de las células inducido por la infección por HCMV.La metodología que se implementó consta de aproximaciones de biología celular y virología básica, que rutinariamente se usan en el laboratorio. El HCMV infecta exclusivamente células humanas, motivo por el que usamos la línea celular humana HK-2 como modelo de células epiteliales tubulares renales para estudiar el impacto de la infección por HCMV. Para estudiar la respuesta autofágica de las células HK-2, analizamos la distribución subcelular y los niveles de la proteína LC3, componente de la membrana autofagosomal y utilizada como marcador de la autofagia. Empleamos dos técnicas diferentes, inmunofluorescencia, y la detección de los niveles de LC3-II mediante Western blot. A su vez, usamos compuestos farmacológicos establecidos como moduladores de la autofagia. Para estudiar el impacto de la infección por HCMV en el volumen celular, las células HK-2 se infectaron con HCMV y el volumen celular medio se medió utilizando el programa Imaris tras la adquisición de imágenes utilizando un microscopio ApoTome. Como procedimiento complementario empleamos citometría de flujo para determinar la variación del volumen, dado que se trata de una poderosa herramienta para el análisis detallado de poblaciones celulares en un corto período de tiempo.Analizamos la polarización de las células infectadas con HCMV estudiando estructuras típicas como son i) hemidesmosomas y adhesiones focales; ii) adherentes de zonula; ii) uniones gap y iv) uniones estrechas, todas ellas implicadas en el mantenimiento de la funcionalidad de la célula epitelial, mediante microscopía confocal comparando células infectadas y no infectadas. En las células epiteliales del túbulo proximal del riñón, el cilio primario (PC) actúa como sensor de las variaciones en los caudales del ultrafiltrado glomerular actuando como un regulador clave de la reabsorción de iones, fosfato inorgánico, glucosa y agua en el túbulo proximal. Exploramos la ciliogénesis en células HK-2 infectadas con HCMV, por inmunofluorescencia. Nuestras observaciones indican que la infección por HCMV induce el aumento del volumen celular a la vez que disminuye el flujo autofágico. Por otro lado la presencia del virus en las células in interfiere ni con el proceso de polarización ni con el de la ciliogenesis. En base a estos resultados hipotetizamos que la modulación de la vía autofágica media el agrandamiento y la pérdida de la funcionalidad de la célula.Por último, el trasplante renal es una de las prácticas más comunes de los últimos años y, junto con ello una de las complicaciones más frecuente es la infección por HCMV. Ésta, causa diversos efectos, como los más comunes podemos mencionar efectos inflamatorios por la liberación de citoquinas, rechazo del aloinjerto y disfunción renal, entre otros. Si bien, existen agentes antivirales que pueden utilizarse en caso de infección por HCMV, no permiten erradicar al virus completamente del hospedador. Además el tratamiento prolongado con agentes antivirales podría asociarse con cierta toxicidad o con la resistencia del patógeno a dicho agente. Por esto consideramos que es de suma importancia primero que nada, conocer y relacionar los diversos efectos que produce la infección por HCMV en células HK-2.Esto nos permite explicar los procesos fisiopatológicos que se desarrollan en un principio, a nivel celular y que luego pueden extrapolarse a los tejidos renales. Creemos que conociendo los efectos que provoca la infección a nivel celular esto puede aportar al desarrollo de investigaciones que permitan el desarrollo de nuevos agentes antivirales específicos para esta infección.