Alteración del metabolismo oxidativo en Staphylococcus aureus

GALERA ILD; ALBESA I; PÁEZ PL

Córdoba

Congreso; . XII Congreso Argentino de Infectología; 2012

El estrés oxidativo es causado por exposición a especies reactivas del oxígeno (ERO) como anión superóxido, peróxido de hidrogeno y radical hidroxilo, los cuales pueden dañar proteínas, ácidos nucleicos y membranas celulares, ante la incapacidad del sistema biológico de desintoxicar rápidamente los reactivos intermedios. Para contrarrestar el estrés oxidativo, las células censan incrementos de ERO y transducen señales para incrementar sus defensas. Las especies reactivas del oxígeno también pueden ser generadas por causas exógenas como la exposición a radiaciones, luz y antibióticos. La capacidad antioxidante celular está dada por mecanismos a través de los cuales la célula anula la reactividad y/o inhibe la generación de radicales libres. Estos mecanismos son adecuados a la muy corta vida media de los radicales libres y comprenden moléculas pequeñas, endógenas y exógenas con capacidad antioxidante. Los sistemas antioxidantes previenen la formación descontrolada de radicales libres y ERO e inhiben su reacción con estructuras biológicas. Las defensas antioxidantes no dependen de una determinada enzima o componente de las células, sino que son afectadas por todos los sistemas enzimáticos y no enzimáticos que tienen la capacidad de reducir radicales del oxígeno. OBJETIVO: Investigar la capacidad de gentamicina de inducir la generación especies reactivas del oxígeno y comparar los cambios generados en el poder reductor de los antioxidantes en condiciones basales o bajo condiciones de estrés oxidativo. MATERIALES Y MÉTODOS: - Estudio de la sensibilidad a antimicrobianos. Las suspensiones bacterianas se obtuvieron a partir de cultivos de 18 hs en agar tripteína soya (ATS) o caldo tripteína soya (CTS). Las mediciones de la CIM para gentamicina (GEN) se realizaron mediante el método de macrodilución en caldo de acuerdo a normas internacionales del CLSI. El inóculo se preparó colocando 4 ó 5 colonias de cada cepa bacteriana en caldo Müeller Hinton y se diluyó para ajustar el inóculo de tal manera que contenga 5x105 UFC/mL. - Determinación de especies reactivas del oxígeno por quimioluminiscencia. Las suspensiones bacterianas se prepararon en CTS hasta alcanzar una DO600=1. Se incubaron 0,3 mL de la suspensión bacteriana; 0,3 mL de lucigenina 0,145 mM y 0,3 mL de GEN en diferentes concentraciones o PBS (control). Luego, se agregó 100 μL de DMSO para permeabilizar las bacterias. Las determinaciones se realizaron a temperatura ambiente en un luminómetro BIO ORBIT 1253. Los resultados de la emisión de luz se expresaron como Unidades Relativas de Luz (URL) en función del tiempo. - Determinación de la capacidad antioxidante total. Para determinar la capacidad antioxidante bacteriana se adaptó un método de determinación en fluidos biológicos, el ensayo FRAP (Ferric reducing/antioxidant power assay) el cual mide el poder reductor total de los antioxidantes. Esta técnica, se basa en la reducción de Fe3+ por una fuente de electrones para formar Fe2+ que consecuentemente reaccionará con 2,4,6-tris (2-piridil)-1,3,5-triazina para formar un complejo azul cuya absorbancia se determina espectrofotométricamente a 593 nm. RESULTADOS: Las cepas de S. aureus presentaron distinta sensibilidad a GEN. Los valores de CIM fueron: 4 mg/L (cepa ATCC); 0,25 mg/L (cepa 424) y 32 mg/L (cepa 235). La quimioluminiscencia amplificada con lucigenina nos permitió detectar incrementos en la generación de ERO en las cepas de S. aureus estudiadas. Se observó un efecto dosis-dependiente en la producción de ERO en las cepas de S. aureus sensibles a GEN mientras que en la cepa resistente no se observaron cambios significativos. La cepa 235, resistente a GEN, tuvo un mayor valor de la capacidad antioxidante basal que las cepas sensibles (ATCC y 424) por lo que se podría afirmar que tiene una mayor capacidad de defensa ante el efecto oxidativo generado por el antibiótico. A concentraciones sub-CIM se observó un estímulo de la capacidad antioxidante en las cepas sensibles. Conclusiones : De acuerdo a los resultados obtenidos podemos concluir que GEN logró alterar el metabolismo oxidativo de las cepas de sensibles y de la cepa resistente y que la acción del antibiótico se encuentra relacionada a la generación de estrés oxidativo y a la capacidad antioxidante de la bacteria.