Análisis micro y macrogeográfico de la estructura genética en poblaciones del vector de la enfermedad de Chagas Triatoma infestans (Hemiptera: Reduviidae) mediante la utilización de ADN mitocondrial y microsatélites

PÉREZ DE ROSAS A. R.; SEGURA E. L.; FICHERA L; FUSCO, O; TORRES A. G.; ZHENG L; GARCÍA B. A.

Actualizaciones en artrópodos de interés sanitario II. Argentina publicaciones 2004-2009

CeNDIE-ANLIS-Ministerio de Salud Eds

Año: 2009; p. 71 - 75

Triatoma infestans es el principal vector de la enfermedad de Chagas en América del Sur entre latitudes 10º y 46º S. Los programas de control de la transmisión de la enfermedad de Chagas promueven la eliminación de las poblaciones del vector T. infestans mediante la fumigación con insecticidas piretroides en las regiones endémicas. Sin embargo, existen dificultades en nuestro país para evitar la recuperación de las poblaciones en las áreas tratadas. La efectividad a largo plazo de las campañas de control es en gran medida dependiente del conocimiento de la estructura de las poblaciones del vector. Investigaciones realizadas en numerosas especies han revelado la importancia del análisis del ADN en estudios evolutivos y genético-poblacionales. Gran parte de esas investigaciones se han llevado a cabo utilizando secuencias de genes mitocondriales. En un trabajo preliminar realizado en nuestro laboratorio, se analizó la variabilidad de secuencias de ADN mitocondrial de los genes ribosomales 12S (371 pares de bases) y 16S (507 pares de bases) en poblaciones naturales de T. infestans pertenecientes a 5 localidades de Argentina. El mayor grado de variación se detectó en el fragmento analizado para el gen 16S. El análisis comparativo de las secuencias de ambos genes (878 pares de bases) reveló la existencia de 13 haplotipos determinados por un total de 17 sitios variables. La diversidad haplotípica y los haplotipos exclusivos encontrados en las dos poblaciones pertenecientes a las localidades geográficamente más cercanas analizadas sugirieron que, después de las intervenciones de control, esas poblaciones se habrían recuperado a partir de sobrevivientes propios de esa área. Posteriormente, se amplió este estudio con el análisis de la variabilidad del fragmento de 507 pares de bases del gen ribosomal mitocondrial 16S en 130 ejemplares de T. infestans pertenecientes a 16 localidades de Argentina (4). El análisis comparativo de las secuencias reveló una variación limitada de este gen con un total de 18 haplotipos diferentes determinados por 21 sitios variables. De esos haplotipos, 15 se presentaron en forma exclusiva en una población, sugiriendo limitados niveles actuales de flujo génico. Las poblaciones de T. infestans pertenecientes al área central de Argentina presentaron los niveles de diversidad haplotípica y nucleotídica más elevados y se diferenciaron significativamente de aquellas de las regiones del nordeste (NE) y del noroeste (NO) que prácticamente no mostraron variabilidad. Esta ausencia de variación se podría interpretar como el resultado de reducciones del tamaño poblacional producidas por la implementación de insecticidas que conducirían a la pérdida de variación genética por efectos de la deriva génica. Los haplotipos exclusivos o de muy baja frecuencia detectados en el fragmento estudiado del gen 16S podrían perderse en este proceso (4). Los resultados obtenidos con secuencias de ADN de genes que presentan variabilidad limitada como los de 12S y 16S revelaron la importancia de continuar con estos estudios y de investigar marcadores genéticos más variables con el propósito de aportar nuevas bases para orientar el diseño de futuras estrategias de control. Entre los nuevos métodos basados en el análisis de ADN que han permitido estudiar con gran resolución la variación genética de poblaciones, se encuentra el que utiliza a los microsatélites como marcadores genéticos. Los microsatélites son secuencias relativamente cortas de ADN, constituidas por unidades repetidas de 6 o menor número de pares de bases, que han demostrado ser polimórficas en cuanto a su longitud en el genoma eucariota. Con el propósito de evaluar la utilidad de este tipo de marcadores en el análisis de la estructura genética de poblaciones naturales del vector de la enfermedad de Chagas T. infestans, preliminarmente aislamos un total de 93 loci de microsatélites a partir de una librería genómica parcial de esa especie (1). Esta biblioteca se construyó digiriendo ADN genómico de T. infestans con las enzimas de restricción Sau3AI y HpaII. Los fragmentos de ADN resultantes de las digestiones enzimáticas fueron separados por electroforesis en gel de agarosa, a partir del cual se aislaron y purificaron fracciones de 250 a 1000 pares de bases. Los fragmentos correspondientes a las diferentes fracciones seleccionadas (las de Sau3AI y las de HpaII) fueron posteriormente insertados en los sitios BamHI y AccI, respectivamente, del vector M13mp19 (New England Biolab). A continuación se llevó a cabo la clonación transformando células competentes XL-IBlue con la mezcla de ligación (ADN recombinado: vector y ADN inserto). Posteriormente, se realizó el screening de las bibliotecas de ADN genómico mediante oligonucleótidos d(GT)15 marcados radiactivamente con 32P. De aproximadamente 16.000 placas recombinantes con insertos de 250-1000 pares de bases se detectaron 210 placas positivas. Se secuenciaron 104 insertos de ADN genómico y su posterior análisis redituó un total de 93 loci microsatelitales. En base a los datos de secuencias obtenidos de los 93 loci de microsatélites aislados se diseñaron primers(oligonucleótidos complementarios con cada una de las hebras de ADN en los extremos que flanquean el segmento de ADN de interés) para amplificar 30 de esos loci. Los 30 pares de primers diseñados específicamente para T. infestans permitieron amplificar, mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR), los segmentos correspondientes de ADN de microsatélites a partir del ADN total extraído de T. infestans. Entre los loci de microsatélites que resultaron polimórficos se seleccionaron 10 con el propósito de analizar la estructura genética de poblaciones naturales de T. infestans (1). Los pares de primers que amplifican los 10 loci seleccionados se utilizaron, además, en otras dos especies potencialmente importantes desde el punto de vista epidemiológico, Triatoma guasayana y Triatoma sordida; cinco de esos loci fueron amplificados para la primera especie y sólo dos en la segunda (1). Con el propósito de detectar cambios de variabilidad genética relacionados con el impacto de los insecticidas sobre poblaciones de T. infestans e inferir posibles patrones de recolonización que influirían sobre la eficacia del control, inicialmente utilizamos los 10 loci de microsatélites antes mencionados para estudiar 19 poblaciones de T. infestans localizadas a lo largo del rango de distribución de esta especie en nuestro país (2). Estas poblaciones pertenecían a localidades con diferentes períodos de tiempo transcurrido desde el último tratamiento con insecticida y a 3 localidades que se encontraban en áreas nunca tratadas con insecticidas. Se analizaron un total de 598 ejemplares de T. infestans capturados en el dormitorio y/o en el peridomicilio. El número de alelos por locus de microsatélite varió entre 11 y 33, y la heterocigosis media esperada osciló entre 0,173 y 0,787. Se detectó exceso significativo de homocigotas en algunos de los loci analizados, lo que indicaría subdivisión de las poblaciones y/o presencia de alelos nulos. Con el propósito de verificar si las poblaciones de T. infestans están subdivididas, se realizó un análisis comparativo de muestras obtenidas en 4 casas pertenecientes a la localidad de Siete Árboles (Chaco), en la cual el número de individuos capturados dentro de cada vivienda (entre 11 y 24) permitió realizar este análisis. El grado de diferenciación genética entre las muestras obtenidas en las distintas viviendas analizadas, sugieren la presencia de subunidades de cruzamiento con intercambio génico restringido en las poblaciones de esta especie. Por otra parte, los niveles de diferenciación genética entre poblaciones sugieren que la magnitud de flujo génico entre las mismas no es suficientemente grande como para encubrir diferencias producidas por deriva génica. Se observó correlación estadísticamente significativa entre el grado de diferenciación genética y la distancia geográfica, sugiriendo un modelo de aislamiento por distancia. Este modelo establece que la diferenciación genética entre poblaciones aumenta con la distancia geográfica, debido a que las poblaciones pertenecientes a localidades geográficamente más cercanas tendrían un mayor intercambio génico que aquellas más distantes. La mayoría de las poblaciones de T. infestans pertenecientes a las localidades tratadas con insecticidas mostraron niveles de variabilidad genética similares o mayores a los detectados para aquellas que nunca recibieron tratamiento. Esto es sorprendente, debido a que la reducción poblacional producida durante los intentos de exterminación con insecticidas conduciría a la pérdida de variación genética por efecto de la deriva génica. Una posible explicación de estos resultados es que la reducción del tamaño poblacional durante el tratamiento con insecticidas haya sido sobreestimada. Alternativamente, en poblaciones subdivididas, las reducciones poblacionales severas producidas por los tratamientos con insecticidas podrían dar lugar a eventos de deriva genética independientes que preservarían al azar diferentes combinaciones de alelos en cada subpoblación; es probable que estos eventos seguidos de un incremento de la población conduzcan a preservar la diversidad genética (2). Nuestros resultados apoyan la hipótesis de una posible recuperación de las poblaciones pertenecientes a regiones tratadas con insecticidas a partir de sobrevivientes propios de esas áreas y destacan el valor de los análisis genéticos de poblaciones en la evaluación de la efectividad de los programas de control del vector de la enfermedad de Chagas (2). En el estudio comparativo de poblaciones de T. infestans pertenecientes a localidades que presentaban diferentes períodos de tiempo transcurridos desde el último tratamiento con insecticidas, se ha sugerido que como consecuencia de la aplicación de insecticidas, la deriva genética habría jugado un rol importante en la diferenciación genética entre poblaciones. Este rol es más notorio en aquellas poblaciones que recibieron el tratamiento entre 1 y 5 años antes de la recolección de las muestras que en aquellas que fueron tratadas de 9 a 20 años antes de la fecha de captura (2). Es decir, el tratamiento con insecticidas tendería a acentuar el grado de diferenciación genética a través del proceso de deriva génica. Con el propósito de unificar condiciones para realizar las inferencias genético poblacionales, analizamos muestras provenientes de 6 localidades de la provincia de Catamarca que han sido tratadas con insecticidas con la misma frecuencia e igual período de tiempo transcurrido desde la última aplicación (3). Se analizó además la distribución microgeográfica de las frecuencias alélicas de loci de microsatélites en muestras provenientes del ambiente peridoméstico de diferentes casas en una de esas localidades (Medanitos), en la que el número de individuos capturados en cada uno de los peridomicilios (entre 15 y 31) permitió dicho análisis. Por otra parte, se comparó esa muestra obtenida antes de tratamiento con insecticida con la proveniente de otra captura realizada en la misma localidad un año después de ser rociada el área con insecticida y en la que sólo uno de los peridomicilios se encontró infestado con T. infestans (n= 36). Se analizó un total de 238 individuos provenientes de las 6 localidades de Catamarca estudiadas. Los resultados confirmaron que las poblaciones de T. infestans son altamente estructuradas. En la localidad de Medanitos, el grado de diferenciación genética observado entre los peridomicilios confirmó la existencia de subdivisión en las poblaciones de T. infestans. Se observó además déficit de heterocigotas en 2 de esos peridomicilios así como en 2 de las casas estudiadas en Siete Árboles (Chaco), lo que podría sugerir la existencia de endogamia y/o un mayor grado de subdivisión en la población. Por otra parte, no se encontraron diferencias significativas en la variabilidad genética de muestras obtenidas antes y después de tratamiento con insecticidas en la localidad de Medanitos, probablemente el tamaño remanente de la población permaneció suficientemente grande como para mantener la diversidad genética en niveles de pre-tratamiento o bien la existencia de subdivisión en cada vivienda permitiría mantener esos niveles de diversidad (3).