Producción de antraquinonas en raíces transformadas de Rubia tinctorum en un biorreactor de tanque agitado modificado

PERASSOLO, MARÍA; CARDILLO, ALEJANDRA BEATRIZ; GIULIETTI, ANA MARIA; RODRIGUEZ TALOU, JULIAN

Simposio; SAProBio 2014- 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2014

Introducción Las antraquinonas (AQs) son metabolitos secundarios que, además de haber sido utilizados tradicionalmente como colorantes en la industria, presentan numerosas aplicaciones terapéuticas. Entre ellas, cabe mencionar su actividad antitumoral y para el tratamiento de la Hepatitis C. Actualmente, son producidas principalmente por síntesis química, aunque hay una tendencia hacia una ?química verde?, sustentable, que promueve el desarrollo de procesos que minimicen el uso y generación de sustancias peligrosas, disminuyendo así los efectos adversos sobre el medio ambiente. Por este motivo, una alternativa para su obtención es el cultivo in vitro de especies vegetales productoras, como por ejemplo el cultivo de raíces transformadas. Este tipo de cultivo, obtenido por infección del tejido vegetal con Agrobacterium rhizogenes, presenta una alta velocidad de crecimiento con independencia del agregado de reguladores de crecimiento, ausencia de geotropismo, alto grado de ramificación, y capacidad para producir metabolitos secundarios por largos períodos de tiempo. En este trabajo, se buscó optimizar la producción de AQs en cultivos de raíces transformadas de Rubia tinctorum mediante la selección del medio de cultivo y la elicitación, para finalmente escalar la producción en un biorreactor de tanque agitado. Metodología Las raíces fueron obtenidas por infección de explantos de R. tinctorum con A. rhizogenes LBA 9402. Fueron cultivadas en medio sólido y líquido, en condiciones controladas de temperatura (24±2°C), fotoperíodo (16h) y agitación (100 rpm). La transformación se confirmó por PCR. Curva de crecimiento y selección de medio de cultivo: Se ensayaron dos medios de cultivos diferentes: Lloyd y Mc Cowns Woody Plant Medium (WPM) y Gamborg B5, con la mitad de la concentración salina (B51/2), con el agregado de sacarosa (20 g/l). Se inocularon 0,25 g de raíces en erlenmeyers de 100 ml con 25 ml de medio de cultivo. Se tomaron muestras a los 7, 14, 21, 28, 35 y 42 días, y se realizaron las siguientes determinaciones analíticas: biomasa (como peso fresco, PF), pH, conductividad, AQs (intra y extracelulares), sacarosa, fructosa y glucosa. Además se calculó el índice de crecimiento y parámetros cinéticos y estequiométricos de cada cultivo. Ensayos de elicitación: se realizaron en cultivos de raíces en medio B51/2 (0,25 g de raíces con 25 ml del medio en erlenmeyers de 100 ml). Las raíces fueron cultivadas por 14 días en las condiciones habituales, y al cabo de este tiempo se elicitó con metil jasmonato (MeJ) 100 mM. Se tomaron muestras al momento de elicitar y a los 2, 4, y 7 días postelicitación (dpe). En todos los casos, se determinaron: biomasa, pH y AQs intra y extracelulares. Escalado: Se utilizó un biorreactor de tanque agitado (BIOFLO III, New Brunswick Scientific) adaptado para el cultivo de raíces (añadido de una malla plástica plegada en forma de zig-zag alrededor de los bafles). Se inocularon ~10 g de raíces cultivadas en WPM en 1,1 l de medio B51/2. La agitación se realizó para lograr una distribución uniforme de las raíces (150 rpm; 5 minutos). La aireación se mantuvo entre 0,2-0,3 vvm. A los 15 días de cultivo, las raíces fueron elicitadas con 100 µM de MeJ y fueron cosechadas a los 7 dpe. Se realizó la determinación de: pH, conductividad, sacarosa, glucosa y fructosa (en medio de cultivo), y de AQs (intra y extracelulares). En paralelo se llevó a cabo un ensayo en erlenmeyers. Resultados Selección del medio de cultivo: Las raíces cultivadas en WPM presentaron una mayor velocidad específica de crecimiento, lo que se tradujo en una mayor producción de biomasa (58,6% superior al cabo de 42 días; p