IDENTIFICACIÓN, CLONADO, EXPRESIÓN Y PRODUCCIÓN DE ENDOLISINAS ANTIESTAFILOCÓCICAS CODIFICADAS EN FAGOS LOCALES.

BALABAN, CECILIA L.; BONCOMPAIN, CARINA; SUÁREZ, CRISTIAN; CECCARELLI, EDUARDO A.; MORBIDONI, HECTOR R.

Quilmes

Jornada; Primeras Jornadas Latinoamericanas de Bacteriófagos; 2019

Red Argentina de Bacteriófagos

El incremento significativo en el número de infecciones debido a cepas bacterianas resistentes a uno o más de los antibióticos clásicos, así como el retraso en la aparición de nuevas drogas antibióticas, instalaron la necesidad de recurrir a terapias alternativas para controlar estas infecciones. Los bacteriófagos, virus que atacan bacterias, producen durante su ciclo replicativo enzimas denominadas endolisinas, las cuales son potencialmente útiles para combatir bacterias de manera específica dado que actúan como peptidoglicano hidrolasas, atacando diferentes enlaces esenciales del peptidoglicano de la pared celular bacteriana. La conservación de las rutas biosintéticas hace extremadamente difícil la selección de bacterias resistentes a endolisinas. El hecho de ser activas sobre bacterias Gram (+) sensibles o resistentes a antibióticos al ser añadidas externamente, refuerza la posibilidad de uso terapéutico de las endolisinas. Staphylococcus aureus es un patógeno Gram (+) de altísima relevancia mundial tanto por afectar a humanos y animales, como por su agresividad y capacidad de resistir numerosos antibióticos. En este laboratorio se han aislado y caracterizado previamente bacteriófagos temperados de cepas locales de S. aureus y se han identificado y clonado una selección de sus endolisinas. Dichas enzimas presentan una estructura modular con dos dominios catalíticos (CHAP y AMI2/3) y un dominio de reconocimiento (SH3) similar a los descriptos en la literatura. Reportamos aquí los estudios de expresión, purificación y rendimiento de las endolisinas seleccionadas utilizando cultivos a escala de laboratorio. Se han logrado purificar endolisinas en cantidad y con un buen grado de pureza lo cual ha permitido la determinación de parámetros de interés a la hora de evaluar su poder antibacteriano. Alícuotas de las purificaciones fueron activas en placas indicadoras de la cepa de S. aureus RN4220 así como en zimogramas ?sistema de detección de actividad peptidoglicano hidrolasa en geles de poliacrilamida-. A su vez, el recuento de UFC en placas de TSA (tripteína soya agarizada) mostró que un tratamiento de 20 min con 50 µg/mL de endolisina fue suficiente para disminuir en 5 logs un cultivo de S. aureus RN4220. Para evaluar la cinética de la hidrólisis se empleó el ensayó de reducción de la turbidez en el que un cultivo en fase exponencial de esta cepa fue enfrentado a concentraciones crecientes de endolisina en diferentes condiciones, obteniendo actividades específicas promedio de 7 ∆DO.min-1.mg endolisina-1 en buffer Tris-NaCl complementado con CaCl2; asimismo confirmamos el requerimiento de Ca2+ por parte de estas enzimas al observar la pérdida de actividad bacteriolítica en presencia de EGTA. En suma, hemos puesto a punto la expresión y purificación de endolisinas antiestafilocócicas codificadas en fagos locales y comprobado que las mismas son capaces de destruir a esta bacteria en cortos períodos de tiempo.