Estrategias de microscopia de correlacion (CLEM) em criosecciones para la deteccion de receptores anti-mitogenicos en células tumorales

PICECH, F; LEIMGRUBER, C.; SOSA L DEL V.; TORRES, A I; PETITI, JP

La Falda

Congreso; 5to Congreso Argentino de Microscopía - SAMIC 2018; 2018

En los últimos años, investigaciones en áreas biológicas relacionadas al estudio de expresión,localización y tráfico de proteínas han permitido comprender los mecanismos moleculares queregulan las principales respuestas biológicas. Para comprender mejor estos mecanismos, esnecesario conocer detalladamente la dinámica intracelular de proteínas siendo lainmunofluorescencia y la inmunomarcación a nivel de microscopía electrónica (MET), lasherramientas más apropiadas.Si bien la microscopía de luz ofrece un screening rápido de grandes áreas y la detecciónsimultánea de múltiples antígenos, la MET permite la visualización de objetos, inmunomarcadoso no, en alta resolución. Actualmente, se han desarrollado nuevas metodologías de miscroscopíade correlación (CLEM), que combina los beneficios de la microscopía de luz con la altaresolución y el detalle ultraestructural de la MET. Además de las técnicas convencionales demarcación a nivel ultraestructural, el desarrollo de metodologías de crio-inmuno MET hanpermitido obtener una mayor sensibilidad para detectar diferentes antígenos.El objetivo de este trabajo consiste en poner a punto diferentes metodologías de CLEM a partirde criosecciones (técnica de Tokuyasu) para detectar receptores de señales anti-mitogénicas encélulas tumorales adenohipofisarias.Se evaluaron dos estrategias: Corte fino (90 nm) montado en grillas de MET y cortes seriadosdonde una sección semifina (200 nm) es montada en un portaobjeto y el subsecuente corte finoen grillas para MET. En la primera estrategia, una única criosección se incubó con un anticuerpoprimario y dos secundarios: fluorescente y acoplado a oro coloidal. La grilla fue visualizada pormicroscopia confocal (MC), luego desmontada y contrastada para su observación en MET. Parala segunda estrategia, en la criosección semifina se realizó la inmunofluorescencia para MC,mientras que la subsecuente criosección fina montada en una grilla fue inmunomarcada conanticuerpo secundario unido a oro coloidal, y visualizada por MET. En ambas estrategias lasimágenes de las células de interés obtenidas por MC y MET fueron superpuestas paracorrelacionar la inmunofluorescencia con un contexto ultraestructural.La microscopía de correlación nos permitió observar la inmunofluorescencia de receptores deseñales anti-mitogénicas SSTR5, TbRI o TbRII en un contexto ultraestructural en una mismacélula. La elección de una estrategia dependerá del objetivo del investigador. Si el objetivo es lamayor inmunodetección de la molécula de interés, el uso de cortes seriados sería lo másadecuado debido a que los anticuerpos secundarios no compiten por un mismo primario.Además, la criosección fina permite una óptima visualización de la ultraestructura. Sin embargo,la obtención de cortes seriados resulta compleja ya que requiere destreza en el manejo delultracriomicrótomo y la manipulación del material. Esta limitación puede sortearse utilizandocriosecciones únicas montadas en grillas. En esta opción los anticuerpos secundarios(fluorescente y acoplado a oro) reconocen un mismo primario, por lo que la intensidad de señales menor comparada con la opción anterior.Nuestros resultados indican que la estrategia más adecuada dependerá de la cantidad del antígenode interés. Si es abundante, las criosecciones únicas serán suficientes para su visualización,mientras que para los antígenos de baja expresión la utilización de criosecciones seriadas facilitaría su observación.