Membrane Topology of the Delta 5 Desaturase of Bacillus subtilis

DIAZ AR; MANSILLA, MARÍA C; DE MENDOZA, D

Villa Carlos Paz, Còrdoba, Argentina

Congreso; saib; 2001

La expresión del sistema de desaturación de ácidos grasos esterificadoslipidos de membrana empleado por B. subtilis es inducible a bajas temperaturas de crecimiento.Nuestro grupo de trabajo 1a aislado y caracterizado el gen des de B. subtilis que codifica para una Delta 5 desaturasa de acil lípidos (Des), de 352 residuos aminoacídicos; con un peso molecular estimado de 42kDa; que contiene los tres grupos de histidina (His) conservados en otras desaturasas de membrana. El análisis de la secuencia primaria muestra que Des es una proteína altamente hidrofóbica, con 6 putativos segmentos transmembrana (STM).Los objetivos del presente trabajo fueron estudiar la topología de la proteína Des y analizar el significado funcional de los residuos de His.Para definir la topología se construyeron proteínas quiméricas de Des con la proteina fosfatasa alcalina (PA) de E coli, codificada por el gen phoA. Las uniones se hicieron endominios hidrofílicos que flanquean los putativos STM. La construcción de los genes de fusión fue obtenida clonando segmentos definidos 5´ del gen des bajo el promotor inducibleT7, en el plásmido de expresión en E coli pET 28-a. Luego se clonó el gen phoA en la región 3´ río abajo de las distintas construcciones que contienen losfragmentos del gen des. La expresión de los genes de fusión fue confirmada por análisis de Western blot con un anticuerpo monoclonal anti-PA, de extractos de células enteras de E coli que portan el plásmido con las fusiones. La baja actividad PA de las fusiones Des-PA en las posiciones 74, 187, 230 y 269 indicarian que estos residuos se localizan del lado citoplasmático de lamembrana; mientras que la alta actividad de las fusiones en los sitios 48, 51, 205 y 213 señalarían una ubicación periplasmática de los mismos; quedando asi limitados los STM2,STM5 y STM6. Aprovechando la capacidad de esta enzima para desaturar ácidos grasos de cadena larga esterificados a lipidos de membrana, se analizó la importancia de distintos residuos de His.Mediante mutagénesis sitio dirigida por la técnica de PCR de extensión superpuesta (SDE-PCR)7 residuos de His fueron individualmente convertidos a Ala. Las mutantes His-Ala de las posiciones 80, 116 y 274 fallaron para producir palmitoleato a partir de palmitato demostrando que estos residuos son esenciales para la función catalítica de Des.También se observó pérdida de la actividad enzimática en una mutante con una deleción C-terminal de 58 aminoácidos.