Detección de Toxoplasma gondii en muestras clínicas de pacientes infectados a través de la técnica en cadena de la polimerasa

MÖBBS, ALAN; REINA, SILVIA; RUDZINSKI, MARCELO

Posadas

Jornada; Jornada de Becarios CEDIT; 2016

Centro de Desarrollo e Innovación Tecnológica

Introducción: La toxoplasmosis es una zoonosis de extensión mundial causada por el protista Toxoplasma gondii. La prevalencia global de la enfermedad se encuentra entre el 25 y 30% (1), pero dicho valor varía según la región, como lo indica un estudio de la zona centro este de la Provincia de Misiones donde la seroprevalencia alcanzó el 80% (2). La técnica de PCR es utilizada para el diagnóstico de la enfermedad a partir de diferentes tipos de muestras clínicas. Entre ellas se encuentran el líquido cefalorraquídeo (LCR), líquido amniótico, sangre periférica y humor acuoso (3?5). Como blanco de PCR se destaca el elemento repetitivo de 529 pb (RE529) [GenBank AF146527] desarrollado inicialmente por Homan et al. (6) y ya ampliamente difundido. El elemento repetitivo RE529 se encuentra entre 200 y 300 veces en tándem, siendo más sensible que otros blancos como el gen B1 (7).El objetivo del presente trabajo consistió en la puesta a punto de la técnica de PCR end point para la detección de Toxoplasma gondii en diferentes tipos de muestras clínicas de pacientes infectados.Materiales y Métodos: se utilizó ADN genómico extraído de parásito mantenido en cultivo, cepa RH, tipo I (gentileza del Dr. Gastón Moré, Inmunoparasitología, Facultad de Veterinaria, Universidad Nacional de La Plata). El mismo se cuantificó mediante espectrofotometría (Nanodrop Spectrophotometer) y se realizaron diluciones seriadas 1:10, 1:100, 1:1.000, 1:10.000, 1:50.000. Se puso a punto la técnica de PCR utilizando el par de cebadores Tox9_F y Tox11_R (8), cuyo blanco es RE529 esperándose como producto un amplicón de ~160 pb. La mezcla de reacción consistió en buffer 1X, MgCl2 2 mM, dNTPs 0,1 mM, 0,4 µM de cada cebador y 1U de la enzima Taq DNA Polymerase (Genbiotech). Se utilizó 1 µl de las diluciones previamente mencionadas como ADN molde en un volumen final de 25 µl. El perfil de ciclado consistió en un primer ciclo de desnaturalización a 94 ºC por 7 minutos, luego de 35 ciclos de 94 ºC por 1 minuto, 57 ºC por 1 minuto y 25 segundos a 72 ºC, y un hold final de 10 minutos a 72 ºC. Asimismo, se incluyó un control negativo de reacción carente de ADN molde. Se analizaron los productos de PCR mediante corrida electroforética en geles de agarosa al 2% teñidos con GelRed?. Los productos obtenidos se compararon con un marcador de peso molecular de 100 pb (Plus DNA Ladder, Genbiotech) para determinar su tamaño. Resultados y análisis: La lectura espectrofotométrica del material genético fue de 13,1 ng/µl y la relación de absorbancia 260/280 fue 1,86. El límite de amplificación de la técnica fue la dilución 1:50.000, cuya concentración calculada a partir de la solución inicial fue 0,26 pg de ADNg equivalentes a 4 taquizoitos. Discusión y conclusiones: en el presente trabajo se logró la puesta a punto de la técnica de PCR end point para la detección del protista T.oxoplasma gondii utilizando como blanco el fragmento repetitivo de 529 pb presente en ADN genómico extraído de parásito mantenido en cultivo. El límite de sensibilidad calculado fue 0,26 pg de ADNg equivalente a aproximadamente 4 taquizoitos en un volumen final de 25 µl de reacción. Se debe destacar la importancia de este valor ya que un quiste tisular de T. gondii de edad avanzada puede alcanzar 100 µm de tamaño y contener cientos a miles de células densamente empaquetadas (1). El empleo de la técnica aquí desarrollada permitirá el análisis de muestras clínicas de pacientes infectados en las siguientes etapas del presente proyecto.