VHH anti-VP6 de Rotavirus posee actividad neutralizante in vitro independientemente de los genotipos virales. VHH directed to rotavirus VP6 protein possess neutralizing activity in vitro independent of viral genotypes.

GARAICOECHEA, LORENA; OLICHON, AURELIEN; MARCOPPIDO, GISELA; WIGDOROVICH, ANDRES; MOZGOVOJ, MARINA; SURREY, THOMAS; PARREÑO, VIVIANA

Buenos Aires

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología, AAM, SAV.; 2008

Sociedad Argentina de Virologia, SAV

: Rotavirus (RV) grupo A es uno de las causas mas comunes de diarrea en humanos y animales neonatos. Los viriones son partículas triple cápside. Las proteínas de la cápside externa VP4 y VP7 son altamente variables y representan los principales antígenos neutralizantes. Clasifican al virus en genotipos. La proteína de cápside intermedia, VP6 es una proteína conservada entre los rotavirus grupo A, es altamente inmunogénica y es el antígeno blanco de la mayoría de los tests de inmunodiagnóstico. Hasta el momento anticuerpos dirigidos contra VP6 no han mostrado propiedades neutralizantes in vitro. Los anticuerpos recombinantes de cadena pesada derivados de llama (VHH), son las moléculas más pequeñas con capacidad de unir un antígeno y por lo tanto podrían poseer propiedades diferentes a los anticuerpos convencionales.Objetivo: El objetivo de este trabajo fue realizar una biblioteca de genes de VHH dirigidos contra la proteína VP6 de RV, evaluar su posible uso en diagnóstico y como herramienta para prevenir la diarrea por RV.Materiales y métodos: se inmunizó una llama con cinco dosis de extracto crudo de celulas Sf9 que contenía 500 µg de proteína VP6 recombinante.Cuatro días luego de la última dosis se sangró la llama y se extrajeron las células mononucleares circulantes con gradiente de Ficoll Paque. A partir de las mismas se construyó una biblioteca de genes VHH . Por el sistema de display en fagos se seleccionaron VHH específicos, los genes que los codifican se subclonaron en un vector de expresión y se expresaron en periplasma de E.coli. La especificidad de los VHH se evalupor Western Blot y ELISA. Se testeó su uso como herramientas en el diagnóstico de RV y para optimizarlo se construyeron VHH bivalentes. Se evaluó la capacidad neutralizante de los VHH anti-VP6 contra cepas de RV de distintos genotipos y finalmente utilizando el modelo ratón lactante y desafiando con cepas de RV bovino C486 ó murino ECw, se evaluó la capacidad de los VHH de proteger frente a la diarrea por RV.Resultados: En este estudio se produjo una biblioteca de genes VHH de de 6 x 10^7 clones de diversidad a partir de 6 x 10^8 celulas mononucleares de la llama inmunizada con VP6 recombinante de RV. Por el sistema de fago display se seleccionaron cuatro anticuerpos VHH dirigidos contra VP6 de RV. Los VHH seleccionados reconocieron epitopes conformacionales de VP6 y detectaron por ELISA todas las cepas de Rotavirus provenientes de distintas especies animales y de humanos. Se construyeron VHH bivalentes, lo que optimizó el comportamiento de los VHH como reactivos potenciales para el diagnóstico de RV. Los VHH neutralizaron in vitro todas las cepas de RV testeadas, independientemente de los genotipos y protegieron parcialmente frente a la infección por RV en un modelo ratón lactante. Los VHH con capacidad neutralizante dirigidos contra la proteína VP6 de RV podrían constituir una herramienta esencial para la prevención y el tratamiento de la diarrea por RV. Los VHH seleccionados reconocieron todas las cepas de Rotavirus provenientes de distintas especies animales y de humanos. Los VHH bivalentes son ideales para utilizar en el dianóstico de RV. Los VHH neutralizaron in vitro todas las cepas de RV testeadas, independientemente de los genotipos y protegieron parcialmente frente a la infección por RV en un modelo ratón lactante.