Estudios de transferencia génica en células del tejido nervioso por medio de vectores adenovirales asistidos por fuerzas magnéticas

PARDO J; MOREL GR; CÓNSOLE G; GOYA RG; REGGIANI PC

La Plata

Jornada; Jornadas de Medicina 2012.; 2012

Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de La Plata.

Introducción: Estamos interesados en desarrollar herramientas biotecnológicas destinadas a una futura prevención y tratamiento de los cambios degradativos normales o patológicos que ocurren en el cerebro durante el envejecimiento, como la pérdida de neuronas dopaminérgicas y colinérgicas, cuyo reflejo clínico son las enfermedades de Parkinson y Alzheimer. Se desea desarrollar estrategias terapéuticas que mimeticen los mecanismos neuroprotectores fisiológicos. Dichas estrategias se basan en la transferencia en distintas regiones del cerebro de la rata senil degenes para moléculas neurotróficas que participen en dichos mecanismos naturales deneuroprotección. La alta invasividad que conlleva la inyección directa de vectores terapéuticos enel SNC puede evitarse con la asociación de la transferencia génica con la nanotecnología,combinando la Magnetic Drug Targeting con la magnetofección. Especificamente, nanopartículasmagnéticas (MNP) se asocian con vectores adenovirales recombinantes (RAd) formandocomplejos adenovirales magnéticos (cAdM), que son concentrados en regiones precisas delorganismo por medio de campos magnéticos externos. Se propuso entonces estudiar estatécnica en células del tejido nervioso in vitro e in vivo.Objetivos1) Establecer in vitro la relación óptima de MNP por partícula viral física (PVP) utilizando cAdM.2) Evaluar la eficiencia de la magnetofección en el parénquima cerebral de la rata.Materiales y MétodosComplejos adenovirales magnéticos:Los cAdM fueron generados mezclando diferentes proporciones de MNPs y adenovector,expresado como fg de Fe por partícula viral física (PVP). Se utilizaron dos RAds: el RAd-GFP yel RAd-DsRed, que expresan la proteína fluorescente verde y roja, respectivamente. Se utilizóuna MNP recubierta con polietilenimina, nombrada PEI-Mag2.Estudios in vitroSe utilizaron células gliales B92 incubadas en condiciones estándar de cultivo (37ºC, 5% CO2).Las células se sembraron en placas de 12 pocillos hasta una confluencia del 80% en medio MEMconteniendo 10% de suero fetal bovino y antibióticos-antimicóticos. Los cultivos se incubarondurante 30 minutos con los cAdMs (relación de 12,5 a 0,01 fg Fe/PVP). Después se sometieronlos cultivos durante 30 min a un campo magnético de 2-2.4 T con una placa magnética comercial(Oz Biosciences). Luego de 48 hs, se observó y fotografió la expresión de GFP y DsRed en lasmonocapas celulares con un microscopio de fluorescencia invertido. Además, se cuantificó porespectrofluorometría la intensidad de fluorescencia en los lisados celulares correspondientespara determinar la relación MNP/RAd óptima.Estudios in vivo:Se utilizaron ratas machos Sprague Dawley, las cuales fueron anestesiadas y posicionadas enun aparato estereotáxico. Se inyectó unilateralmente en el hipocampo (-3,8 AP; -2 L; -2,4 V,según el bregma) 20 μl de una suspensión de cAdM: PEI-Mag2/RAd-GFP, en dos relaciones (1,8 y 0,45 fg Fe/PVF). Inmediatamente después, se apoyó un imán cilíndrico sobre el punto deinyección durante 30 min. Dos días después, los animales se perfundieron por vía intracardíacacon PBS-4% paraformaldehído. El cerebro fue cuidadosamente disecado y cortado con unvibrátomo. Se realizaron cortes coronales seriados de 30 μm de espesor, los cuales se montaronen portaobjetos con Fluoromount G. Se observó y fotografió la fluorescencia de GFP con unmicroscopio de fluorescencia.ResultadosEstudios in vitro: Utilizando una concentración de adenovector subóptima de 3,3x107 PFU/ml(3,7x109 PVP/ml) para 3x105 células B92/ml por pocillo se observa que a la relación de 0,5 fgFe/PVP (PEI-Mag2/RAd-GFP) se amplifica 7 veces la transferencia génica respecto al virusdesnudo, magnitud que se mantiene constante a relaciones MNP/RAd mayores. Resultadosequivalentes se obtuvieron con los cAdM PEI-Mag2/RAd-DsRed.Estudio in vivo: Cualitativamente se observó una mayor expresión de GFP en el hipocampo delos animales inyectados con los cAdM, a las dos relaciones usadas, respecto de los animalesque recibieron el virus desnudo.ConclusiónDe los datos aquí presentados concluimos que nuestros vectores adenovirales muestran unamarcada mejora en su performance in vitro cuando se los utiliza complejados con PEI-Mag2. Losresultados de los estudios en el parénquima cerebral son alentadores, pues sugieren una mejorade la performance de la transferencia génica en el hipocampo de las ratas cuando estas sontratadas con los cAdM + imán. No obstante, estos resultados son preliminares y restan realizarmás experimentos que confirmen la eficiencia de la implementación de magnetofección en elcerebro.