INVESTIGADORES
REGGIANI Paula Cecilia
congresos y reuniones científicas
Título:
Estudios de transferencia génica en células del tejido nervioso por medio de vectores adenovirales asistidos por fuerzas magnéticas
Autor/es:
PARDO J; MOREL GR; CONSOLE GM; GOYA RG; REGGIANI PC
Lugar:
La Plata
Reunión:
Jornada; Jornadas de Medicina 2012. Facultad de Ciencias Médicas; 2012
Institución organizadora:
Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de La Plata.
Resumen:
Introducción
Estamos interesados en desarrollar herramientas biotecnológicas destinadas a una futura
prevención y tratamiento de los cambios degradativos normales o patológicos que ocurren en el
cerebro durante el envejecimiento, como la pérdida de neuronas dopaminérgicas y colinérgicas,
cuyo reflejo clínico son las enfermedades de Parkinson y Alzheimer. Se desea desarrollar
estrategias terapéuticas que mimeticen los mecanismos neuroprotectores fisiológicos. Dichas
estrategias se basan en la transferencia en distintas regiones del cerebro de la rata senil de
genes para moléculas neurotróficas que participen en dichos mecanismos naturales de
neuroprotección. La alta invasividad que conlleva la inyección directa de vectores terapéuticos en
el SNC puede evitarse con la asociación de la transferencia génica con la nanotecnología,
combinando la Magnetic Drug Targeting con la magnetofección. Especificamente, nanopartículas
magnéticas (MNP) se asocian con vectores adenovirales recombinantes (RAd) formando
complejos adenovirales magnéticos (cAdM), que son concentrados en regiones precisas del
organismo por medio de campos magnéticos externos. Se propuso entonces estudiar esta
técnica en células del tejido nervioso in vitro e in vivo.in vitro e in vivo.
Objetivos
1) Establecer in vitro la relación óptima de MNP por partícula viral física (PVP) utilizando cAdM.
2) Evaluar la eficiencia de la magnetofección en el parénquima cerebral de la rata.
2) Evaluar la eficiencia de la magnetofección en el parénquima cerebral de la rata.
in vitro la relación óptima de MNP por partícula viral física (PVP) utilizando cAdM.
2) Evaluar la eficiencia de la magnetofección en el parénquima cerebral de la rata.
Materiales y Métodos
Complejos adenovirales magnéticos:
Los cAdM fueron generados mezclando diferentes proporciones de MNPs y adenovector,
expresado como fg de Fe por partícula viral física (PVP). Se utilizaron dos RAds: el RAd-GFP y
el RAd-DsRed, que expresan la proteína fluorescente verde y roja, respectivamente. Se utilizó
una MNP recubierta con polietilenimina, nombrada PEI-Mag2.
Estudios in vitroin vitro
Se utilizaron células gliales B92 incubadas en condiciones estándar de cultivo (37ºC, 5% CO2).
Las células se sembraron en placas de 12 pocillos hasta una confluencia del 80% en medio MEM
conteniendo 10% de suero fetal bovino y antibióticos-antimicóticos. Los cultivos se incubaron
durante 30 minutos con los cAdMs (relación de 12,5 a 0,01 fg Fe/PVP). Después se sometieron
los cultivos durante 30 min a un campo magnético de 2-2.4 T con una placa magnética comercial
(Oz Biosciences). Luego de 48 hs, se observó y fotografió la expresión de GFP y DsRed en las
monocapas celulares con un microscopio de fluorescencia invertido. Además, se cuantificó por
espectrofluorometría la intensidad de fluorescencia en los lisados celulares correspondientes
para determinar la relación MNP/RAd óptima.
Las células se sembraron en placas de 12 pocillos hasta una confluencia del 80% en medio MEM
conteniendo 10% de suero fetal bovino y antibióticos-antimicóticos. Los cultivos se incubaron
durante 30 minutos con los cAdMs (relación de 12,5 a 0,01 fg Fe/PVP). Después se sometieron
los cultivos durante 30 min a un campo magnético de 2-2.4 T con una placa magnética comercial
(Oz Biosciences). Luego de 48 hs, se observó y fotografió la expresión de GFP y DsRed en las
monocapas celulares con un microscopio de fluorescencia invertido. Además, se cuantificó por
espectrofluorometría la intensidad de fluorescencia en los lisados celulares correspondientes
para determinar la relación MNP/RAd óptima.
2).
Las células se sembraron en placas de 12 pocillos hasta una confluencia del 80% en medio MEM
conteniendo 10% de suero fetal bovino y antibióticos-antimicóticos. Los cultivos se incubaron
durante 30 minutos con los cAdMs (relación de 12,5 a 0,01 fg Fe/PVP). Después se sometieron
los cultivos durante 30 min a un campo magnético de 2-2.4 T con una placa magnética comercial
(Oz Biosciences). Luego de 48 hs, se observó y fotografió la expresión de GFP y DsRed en las
monocapas celulares con un microscopio de fluorescencia invertido. Además, se cuantificó por
espectrofluorometría la intensidad de fluorescencia en los lisados celulares correspondientes
para determinar la relación MNP/RAd óptima.
Estudios in vivo:in vivo:
Se utilizaron ratas machos Sprague Dawley, las cuales fueron anestesiadas y posicionadas en
un aparato estereotáxico. Se inyectó unilateralmente en el hipocampo (-3,8 AP; -2 L; -2,4 V,
según el bregma) 20 μl de una suspensión de cAdM: PEI-Mag2/RAd-GFP, en dos relaciones (1,8
y 0,45 fg Fe/PVF). Inmediatamente después, se apoyó un imán cilíndrico sobre el punto de
inyección durante 30 min. Dos días después, los animales se perfundieron por vía intracardíaca
con PBS-4% paraformaldehído. El cerebro fue cuidadosamente disecado y cortado con un
vibrátomo. Se realizaron cortes coronales seriados de 30 μm de espesor, los cuales se montaron
en portaobjetos con Fluoromount G. Se observó y fotografió la fluorescencia de GFP con un
microscopio de fluorescencia.
2012 Noviembre, 2(5): 1-2
Resultados
Estudios in vitro: Utilizando una concentración de adenovector subóptima de 3,3x107 PFU/ml
(3,7x109 PVP/ml) para 3x105 células B92/ml por pocillo se observa que a la relación de 0,5 fg
Fe/PVP (PEI-Mag2/RAd-GFP) se amplifica 7 veces la transferencia génica respecto al virus
desnudo, magnitud que se mantiene constante a relaciones MNP/RAd mayores. Resultados
equivalentes se obtuvieron con los cAdM PEI-Mag2/RAd-DsRed.
Fe/PVP (PEI-Mag2/RAd-GFP) se amplifica 7 veces la transferencia génica respecto al virus
desnudo, magnitud que se mantiene constante a relaciones MNP/RAd mayores. Resultados
equivalentes se obtuvieron con los cAdM PEI-Mag2/RAd-DsRed.
(3,7x109 PVP/ml) para 3x105 células B92/ml por pocillo se observa que a la relación de 0,5 fg
Fe/PVP (PEI-Mag2/RAd-GFP) se amplifica 7 veces la transferencia génica respecto al virus
desnudo, magnitud que se mantiene constante a relaciones MNP/RAd mayores. Resultados
equivalentes se obtuvieron con los cAdM PEI-Mag2/RAd-DsRed.
Fe/PVP (PEI-Mag2/RAd-GFP) se amplifica 7 veces la transferencia génica respecto al virus
desnudo, magnitud que se mantiene constante a relaciones MNP/RAd mayores. Resultados
equivalentes se obtuvieron con los cAdM PEI-Mag2/RAd-DsRed.
in vitro: Utilizando una concentración de adenovector subóptima de 3,3x107 PFU/ml
(3,7x109 PVP/ml) para 3x105 células B92/ml por pocillo se observa que a la relación de 0,5 fg
Fe/PVP (PEI-Mag2/RAd-GFP) se amplifica 7 veces la transferencia génica respecto al virus
desnudo, magnitud que se mantiene constante a relaciones MNP/RAd mayores. Resultados
equivalentes se obtuvieron con los cAdM PEI-Mag2/RAd-DsRed.
Fe/PVP (PEI-Mag2/RAd-GFP) se amplifica 7 veces la transferencia génica respecto al virus
desnudo, magnitud que se mantiene constante a relaciones MNP/RAd mayores. Resultados
equivalentes se obtuvieron con los cAdM PEI-Mag2/RAd-DsRed.
9 PVP/ml) para 3x105 células B92/ml por pocillo se observa que a la relación de 0,5 fg
Fe/PVP (PEI-Mag2/RAd-GFP) se amplifica 7 veces la transferencia génica respecto al virus
desnudo, magnitud que se mantiene constante a relaciones MNP/RAd mayores. Resultados
equivalentes se obtuvieron con los cAdM PEI-Mag2/RAd-DsRed.
Estudio in vivo: Cualitativamente se observó una mayor expresión de GFP en el hipocampo de
los animales inyectados con los cAdM, a las dos relaciones usadas, respecto de los animales
que recibieron el virus desnudo.
los animales inyectados con los cAdM, a las dos relaciones usadas, respecto de los animales
que recibieron el virus desnudo.
in vivo: Cualitativamente se observó una mayor expresión de GFP en el hipocampo de
los animales inyectados con los cAdM, a las dos relaciones usadas, respecto de los animales
que recibieron el virus desnudo.
Conclusión
De los datos aquí presentados concluimos que nuestros vectores adenovirales muestran una
marcada mejora en su performance in vitro cuando se los utiliza complejados con PEI-Mag2. Los
resultados de los estudios en el parénquima cerebral son alentadores, pues sugieren una mejora
de la performance de la transferencia génica en el hipocampo de las ratas cuando estas son
tratadas con los cAdM + imán. No obstante, estos resultados son preliminares y restan realizar
más experimentos que confirmen la eficiencia de la implementación de magnetofección en el
cerebro.
resultados de los estudios en el parénquima cerebral son alentadores, pues sugieren una mejora
de la performance de la transferencia génica en el hipocampo de las ratas cuando estas son
tratadas con los cAdM + imán. No obstante, estos resultados son preliminares y restan realizar
más experimentos que confirmen la eficiencia de la implementación de magnetofección en el
cerebro.
in vitro cuando se los utiliza complejados con PEI-Mag2. Los
resultados de los estudios en el parénquima cerebral son alentadores, pues sugieren una mejora
de la performance de la transferencia génica en el hipocampo de las ratas cuando estas son
tratadas con los cAdM + imán. No obstante, estos resultados son preliminares y restan realizar
más experimentos que confirmen la eficiencia de la implementación de magnetofección en el
cerebro.