OPTIMIZACIÓN DE UN MÉTODO BIOAUTOGRÁFICO PARA LA DETECCIÓN DE INHIBIDORES DE Mycobacterium smegmatis

RAMALLO, I AYELEN; GAGO, GABRIELA; FURLAN, RICARDO; GRAMAJO, HUGO

Rosario

Congreso; XXI Congreso y XXXIX Reunión Anual de la SBR 2019; 2019

Sociedad de Biología de Rosario

La tuberculosis (TB) es la enfermedad infecciosa de mayor tasa de mortandad a nivel mundial cuyo agente causal en humanos es Mycobacterium tuberculosis. La continua aparición de cepas multi-resistentes y la re-emergencia de TB demandan el descubrimiento de nuevas drogas que puedan lidiar con esta situación y a la vez, reducir la duración y complejidad de las terapias actuales. Los extractos naturales representan una de las fuentes más importantes de nuevos quimiotipos con potencial terapéutico. Lamentablemente, como son mezclas complejas, el hecho de encontrar un extracto con la actividad deseada representa solo el comienzo de un largo y costoso proceso de fraccionamiento. Esto hace necesario el desarrollo de bioensayos sencillos que permitan adjudicar la actividad observada en una mezcla a los componentes responsables de la misma antes de ser separados. Este trabajo tiene como objetivo la optimización de un método autográfico que combina la capacidad separativa de la cromatografía en capa delgada (CCD) con un ensayo microbiológico con Mycobacterium smegmatis. M. smegmatis es empleado como modelo de estudio de M. tuberculosis, por ser una especie no patógena y de crecimiento rápido. Para el desarrollo de la metodología se utilizaron placas de CCD Silica Gel GF254 de 30.3 cm2 sembradas en el centro con 10 µg de isoniacida (INH) (inhibidor de referencia). Se analizaron 5 variables: concentración de LB-agar (1-2%p/v), volumen final de LB-agar a distribuir sobre la placa (0.13-0.20 mL/cm2), presencia/ausencia de tiloxapol (0.03 %v/v), cantidad de inóculo inicial (DO=0.6, 2.5-6.3 µL/cm2) y tiempo de incubación (24-48 hs). La combinación de todos los factores bajo estudio generó 18 ensayos que al término se revelaron con MTT para evidenciar las zonas de crecimiento, y se fotografiaron a los 30 min. Con el objetivo de optimizar el ensayo, las imágenes se trabajaron en escala de grises definiéndose 3 respuestas experimentales: A) sensibilidad medida a través del diámetro del halo; B) contraste halo-matriz medido a través de la diferencia entre valores de pixeles de la matriz vs centro del halo; C) homogeneidad de la matriz medida como el desvío estándar de puntos de una línea trazada sobre la matriz. Se empleó GelPro 3.0 para la medición de las respuestas experimentales. Los resultados muestran que: 1) no hay crecimiento a 2%p/v de agar y sí a 1%p/v; 2) la presencia de tiloxapol genera matrices con colonias distribuidas más homogéneamente; 3) un mayor tiempo de incubación y una mayor cantidad de inóculo inicial genera mayor contraste de color halo-matriz; 4) a menor volumen final distribuido, mayor es el tamaño del halo ganando sensibilidad. Por estas razones, se decidió trabajar con: 0.13 mL/cm2 de 1%p/v de LB-agar, 6.3 µL/cm2 de inóculo y 0.03%v/v mL de tiloxapol. Para testear el ensayo se revelaron con esta solución CCDs de aceites esenciales de conocida actividad antimicobacteriana. Luego de 48 hs de incubación, las placas se rociaron con MTT visualizando los halos de inhibición. Para determinar el límite de detección se sembraron cantidades decrecientes de INH en punto sobre una placa de CCD y se la reveló bioautográficamente. La INH se detectó hasta cantidades < 0.6 µg. El bioensayo descripto es rápido, sencillo y permite el análisis de varias muestras en simultáneo. Estas características lo hacen interesante como método para la búsqueda de antimicobacterianos en mezclas complejas.