Desde la bioautografía al espectrómetro de masas: identificación de inhibidores de acetilcolinesterasa

RAMALLO, IA; SALAZAR, MO; GATTI, PABLO; FURLAN, RLE

Mar del Plata

Simposio; XIX Simposio Nacional de Química Orgánica; 2013

Sociedad Argentina de Investigación en Química Orgánica

En el último siglo se ha registrado un aumento en la incidencia de enfermedades neurológicas como la enfermedad de Alzheimer. Actualmente, el único tratamiento consiste en el uso de inhibidores de acetilcolinesterasa (AChE).1 Las fuentes naturales constituyen el principal acervo de inhibidores de AChE; sin embargo, la búsqueda de compuestos activos en extractos no es tarea sencilla. De aquí la necesidad de desarrollar estrategias simples, que brinden una rápida conexión entre bioactividad y datos, facilitando la identificación de los constituyentes bioactivos. Se presenta aquí una metodología que combina la habilidad de la bioautografía para detectar in situ inhibidores en mezclas, con la capacidad de la espectrometría de masas de alta resolución (EMAR) para identificar estructuras. La misma se basa en que la composición química no vinculada con la bioactividad en un halo de inhibición puede ser distinta en CCDs (Cromatografías en Capa Delgada) de la misma muestra realizadas con distintos sistemas de solventes. La comparación de espectros de masa de dichos halos permitiría identificar el compuesto activo, ya que revelará los iones comunes a todos los espectros. El proceso involucra: 1) bioautografía de CCDs desarrolladas con diferentes solventes; 2) extracción de muestras de los halos de inhibición y control de la matriz; y 3) obtención y comparación de espectros de masa. Dado que esta estrategia no podía implementarse usando las bioautografías reportadas,2 se desarrolló un ensayo que emplea acetato de 1-naftilo/Fast blue-B y AChE inmovilizada en un gel agar. Para analizar los espectros se desarrolló un algoritmo en MatLab que usa dos parámetros: nivel de filtro NF y tolerancia Tol. El NF define la intensidad umbral por encima de la cual se considera una señal como significativa. La Tol define el rango m/z dentro del cual se asume que dos valores son iguales. La rutina consiste en: I) filtrar el espectro de masas de la muestra #1 y su control con un valor NF; II) restar el control #1 filtrado a la muestra #1 filtrada; III) repetir los pasos I y II con las muestras #2 y #3; IV) identificar los valores de m/z comunes en las muestras #1, #2 y #3. La técnica se testeó con el extracto metanólico de Brassica rapa (inactivo ante AChE) pinchado con 1% y 0.1% de eserina, identificando dos valores m/z para eserina: m/z=276,1702(M+1) y m/z=298,1524(M+Na). La misma estrategia aplicada al extracto metanólico bioactivo de Ilex paraguariensis, reveló dos valores m/z pertenecientes a cafeína (alcaloide responsable de la actividad). Este trabajo ilustra la factibilidad de asignar fórmulas moleculares a compuestos activos presentes en mezclas complejas directamente desde bioautografía.