Nuevo Método Autográfico para la Detección de Inhibidores de Xantin Oxidasa y Captadores de Radical Superóxido

RAMALLO, IA; ZACCHINO, SA; FURLAN, RLE

Tucuman

Jornada; XIII Jornadas de Jóvenes Investigadores AUGM 2005; 2005

Asociación de Universidades Grupo Montevideo

INTRODUCCIÓN La naturaleza es fuente de una enorme diversidad molecular con alto potencial terapéutico. Este hecho ha puesto de manifiesto la necesidad de encontrar estrategias innovadoras que permitan aprovechar la diversidad química de los productos naturales en el proceso de descubrimiento de drogas. Una estrategia posible surge de la combinación de un método separativo en escala analítica con un método de detección in situ de una actividad biológica como ocurre en los métodos autográficos. La metodología consiste en separar por cromatografía en capa fina los componentes de un extracto o subextracto y luego ?revelar? la placa cromatográfica usando un método de tinción que permita reportar alguna actividad biológica. De esta forma, los componentes activos de la mezcla son detectados por los halos que ellos producen. Los métodos autográficos son usados como un ensayo para determinar actividad antibacteriana y antifúngica. La metodología ha sido mencionada como la más eficiente para el descubrimiento de nuevos compuestos antimicrobianos y constituye una herramienta útil para guiar el aislamiento de compuestos activos a partir de mezclas complejas como son los extractos naturales. Más recientemente se extendió el concepto de autografía hacia un nivel enzimático al desarrollarse un ensayo para la detección de actividad inhibidora de acetilcolinesterasa. Hasta el momento, esta enzima es la única biomolécula que ha sido utilizada en autografía. En este trabajo se describe el desarrollo de un nuevo método autográfico para la detección de actividad inhibitoria de la enzima Xantina Oxidasa (XO). La XO (EC 1.1.3.22) cataliza la hidroxilación oxidativa de hipoxantina a xantina y subsecuentemente de xantina a ácido úrico. Durante la reoxidación de la XO, el oxígeno (O2) actúa como aceptor de electrones. La reducción parcial del O2 genera simultáneamente los intermediarios radical superóxido (O2-.) y peróxido de hidrógeno (H2O2). La XO está compuesta de dos subunidades idénticas, catalíticamente independientes. Cada una contiene una molibdopterina (Mo), dos centros hierro-azufre (Fe2S2) y una flavina adenina dinucleótido (FAD). La hidroxilación oxidativa, de xantina a ácido úrico toma lugar en el centro Mo el cual se reduce de MoVI a Mo IV. En la media reacción reductiva, la xantina es oxidada a ácido úrico y dos electrones son transferidos desde la xantina al centro Mo y subsecuentemente al FAD a través de los Fe2S2. En el FAD ocurre la media reacción oxidativa donde el O2 es reducido a O2-. o H2O2. La XO es la última enzima de la ruta de degradación de los nucleótidos purínicos generando como productos finales de excreción ácido úrico, O2- y H2O2. La sobreproducción de cualquiera de ellos ha sido relacionada con: hepatitis de etiologías múltiples, colecistitis, repercusión-isquemia, estrés térmico, hipercolesterolemia, carcinogénesis, entre otras. Además la actividad incrementada de XO es considerada como una fuente de estrés oxidativo. Esto es, el desbalance entre la generación de especies reactivas de oxígeno (EROs) tales como O2- o H2O2 y las defensas antioxidantes del organismo. Las EROs oxidan proteínas, lípidos, ácidos nucleicos, carbohidratos y otros componentes celulares. Se sabe que los niveles de suero de la XO están significatimamente incrementados en varios estados patológicos y que las EROs generadas en el proceso enzimático están involucrados en el daño oxidativo. Así que la inhibición de esta ruta enzimática puede tener un importante interés terapéutico. Particular atención debe ser puesta en la injuria producida por hipoxia durante la reperfusión de tejidos isquémicos. La ausencia de O2 causa la inactividad de la XO lo que lleva a la acumulación de hipoxantina y de xantina. Durante la reperfusión, cuando los niveles de O2 vuelven a la normalidad, la XO cataliza sus reacciones a máxima velocidad generando cantidades masivas de O2- y H2O2. Esta situación puede potenciarse debido al aumento de la cantidad de XO por conversión de la Xantina Deshidrogenasa (XD). Esto se debe a que XO y XD son formas interconvertibles del mismo producto génico. La forma predominante en tejidos saludables y bien oxigenados es XD que usa NAD+ como cosustrato y no genera EROs. Sin embargo, bajo condiciones patológicas como isquemia-reperfusión, XD puede ser convertida a XO. Este mecanismo influencia la severidad del daño en órganos transplantados o reperfundidos. El exceso de ácido úrico, también resulta dañino. Éste se encuentra a pH fisiológico mayoritariamente en forma de urato, el cual tiene solubilidad limitada en agua. Un exceso de la producción in vivo puede llevar a la deposición de los cristales en varios lugares, particularmente en las articulaciones, el tejido conectivo, y los riñones. La enfermedad conocida como gota tiene como causa inicial el desarrollo de hiperuricemia y aparece cuando los cristales de urato inducen una respuesta inflamatoria. La meta de la terapia antihiperuricémica es reducir los niveles de ácido úrico en suero por debajo del umbral requerido para la sobresaturación del fluido extracelular. Las dos clases de drogas disponibles para tal efecto son las drogas uricosúricas (incrementan la excreción urinaria de urato) y los inhibidores de XO (bloquean el paso final de la síntesis de urato reduciendo su producción). El alopurinol es el único inhibidor de XO de uso clínico. Se une al sitio activo para producir oxipurinol el cual se mantiene unido fuertemente al mismo reforzando el efecto inhibidor. Al inhibirse la XO, los productos de excreción son la xantina y la hipoxantina, que son más solubles en agua que el ácido úrico y tienen menor probabilidad de formar depósitos de cristales. Desafortunadamente, el alopurinol presenta efectos adversos como hipersensibilidad, resequedad en la piel y trastornos gastrointestinales. Si bien en este momento hay dos nuevas drogas en ensayos clínicos (Febuxostat y Y-700), nuevos tratamientos para la hiperuricemia son necesarios. 3.4 Detección de la actividad enzimática a través de la detección de la producción de ácido úrico mediante el reactivo fosfo-litio-túngstico 3.4.a Ensayo de interferencias de la mezcla de reacción enzimática sobre la reacción de coloración Se prepararon soluciones puras de los diferentes componentes de la reacción enzimática y soluciones que contenían mezclas de los mismos, en ausencia y en presencia de un testigo de ácido úrico respectivamente. La composición de las soluciones se detalla en la Tabla I. Dichas soluciones se revelaron agregando a cada tubo 1mL de solución de Na2CO3 seguido del agregado de 1mL de solución de fosfo-litio-túngstico, del kit Uricostat. 3.4.b Ensayo de efectos de la sílica gel sobre la reacción de coloración Se sembraron las siguientes cantidades decrecientes de ácido úrico cada una en un punto (de aproximadamente 0,09cm2 ) sobre una placa para TLC: 2µg, 1µg, 0,5µg, 0,25µg, 0,125µg, 0,0625µg, y 0,0312µg. Las siembras se dejaron secar a temperatura ambiente (T amb.). Una vez seca la placa fue revelada a través del rociado con una solución de Na2CO3. El rociado se secó bajo corriente de aire a T amb. antes de proceder al rociado con una solución de fosfo-litio-túngstico. Por otro lado, otra placa para TLC sembrada con las mismas cantidades de ácido úrico patrón fue revelada sin secar previamente las siembras. 3.4.c Ensayo de viabilidad de la reacción de coloración a pH 7.90 Se preparó una solución compuesta por: 50µL de ácido úrico 1g/L, 1mL de buffer fosfato 200mM, y 1mL de solución de fosfo-litio-túngstico. Luego se agregó sobre la solución anterior 1mL de solución de Na2CO3. 3.4.d Autografía enzimática XO/reactivo-fosfo-litio-túngstico: sistema depositado por adsorción directa sobre TLC Solución reveladora Se preparó una solución compuesta por buffer fosfato, EDTA, y XO, mezclando por inversión suave. Concentraciones finales: buffer fosfato pH 7,90 (102,80mM), EDTA (2,05mM), y XO (140,19mU/mL). Volumen final: 4,28mL. Procedimiento Sobre una placa de TLC de 45cm2 se sembraron puntos con 0,5μg/punto de alopurinol. Una vez secas las siembras por evaporación bajo corriente de aire a T amb., la placa se roció con una solución 1,5mM de xantina. Luego del rociado de sustrato, sin dejar secar completamente la placa, se procedió al rociado de 4,28mL de solución reveladora sobre la misma. La placa se situó en cámara húmeda a 28°C 30 minutos. La placa posteriormente fue rociada con una solución de Na2CO3 y, luego de 10 minutos a T amb., con una solución de fosfo-litio-túngstico. La placa se secó con corriente de aire a T amb. entre el rociado de dichas soluciones. Los pasos de rociado de la solución de Na2CO3 y la solución de fosfo-litio-túngstico se repitieron hasta color constante. 3.4.e Autografía enzimática XO/reactivo-fosfo-litio-túngstico: sistema inmovilizado por atrapamiento en gel Solución reveladora Agar o agarosa LGT se disolvieron a 80ºC en una solución compuesta por buffer fosfato y EDTA, La solución resultante se enfrió hasta 50ºC. A esta temperatura se agregó la XO y se mezcló nuevamente por inversión suave. Concentraciones finales: agar o agarosa (0,9% P/V), buffer fosfato pH 7,90 (50,69mM), EDTA (1,01mM), y XO (69,12mU/mL).Volumen final: 8,68mL. Procedimiento Sobre una placa de TLC de 45cm2 se sembraron puntos con 0,5μg/punto de alopurinol. Una vez secas las siembras por evaporación bajo corriente de aire a T amb., la placa se roció con una solución 1,5mM de xantina. Luego del rociado de sustrato, sin dejar secar completamente la placa, los 8,68mL de solución reveladora, a una temperatura de 50ºC, se distribuyeron sobre toda la superficie de la placa de TLC de manera de generar una capa de espesor uniforme. Una vez gelificada la solución la placa se situó en cámara húmeda a 28°C 30 minutos. Transcurrido ese tiempo se sumergió la placa en una solución de Na2CO3 por 10 minutos a T amb. y luego en una solución de fosfo-litio-túngstico, por 10 minutos a T amb. 3.5 Detección de la actividad enzimática a través de la detección de la producción de peróxido de hidrógeno a través de peroxidasa 3.5.a Autografía enzimática XO/POD: sistema depositado por adsorción directa sobre TLC Solución reveladora Se preparó una solución compuesta por buffer fosfato, EDTA, y XO. Se mezcló por inversión suave. Concentraciones finales: buffer fosfato pH 7,90 (102,80mM), EDTA (2,05mM), y XO (140,19mU/mL). Volumen final: 4,28mL. Procedimiento Sobre una placa de TLC de 45cm2 se sembraron puntos con 0,5μg/punto de alopurinol. Una vez secas las siembras por evaporación bajo corriente de aire a T amb., la placa se roció con una solución 1,5mM de xantina. Luego del rociado de sustrato, sin dejar secar completamente la placa, se procedió al rociado de los 4,28mL de solución reveladora sobre la misma. La placa se situó en una cámara húmeda a 28°C 30 minutos. La placa posteriormente fue rociada con la solución reveladora de peróxido y situada nuevamente en la cámara húmeda para que proceda la reacción enzimática de detección, por 30 minutos a 28°C en la oscuridad. 3.5.b Autografía enzimática XO/POD: sistema inmovilizado por atrapamiento en gel Solución reveladora Agar o agarosa LGT se disolvieron a 80ºC en una solución compuesta por buffer fosfato, EDTA, La solución resultante se enfrió hasta 50ºC. A esta temperatura se agregó XO y POD y se mezcló nuevamente por inversión suave. Concentraciones finales: agar o agarosa (0,9% P/V) buffer fosfato pH 7,90 (50,69mM), EDTA (1,01mM), XO (69,12mU/mL), POD (193,55mU/mL). Volumen final: 8,68mL. Procedimiento Sobre una placa de TLC de 45cm2 se sembraron puntos con 0,5μg/punto de alopurinol. Una vez secas las siembras por evaporación bajo corriente de aire a T amb., la placa se roció con una solución 1,5mM de xantina. Luego del rociado de sustrato, sin dejar secar completamente la placa, los 8,68mL de solución reveladora, a una temperatura de 50ºC, se distribuyeron sobre toda la superficie de una placa de TLC de manera de generar una capa de espesor uniforme. Una vez gelificado la placa se situó en una cámara húmeda a 28°C durante 30 minutos, en la oscuridad. Transcurrido ese tiempo se sumergió en la solución de fenol y 4-AF por 30 minutos a temperatura de 28°C en ausencia de luz. 3.6 Detección de la actividad enzimática a través de la detección de la producción de O2-. mediante el reactivo NBT 3.6.a Autografía enzimática XO/NBT: sistema depositado por adsorción directa sobre TLC Solución reveladora Se preparó una solución compuesta por buffer fosfato, EDTA, NBT y XO. Se mezcló por inversión suave. Concentraciones finales: buffer fosfato pH 7,90 (102,80mM), EDTA (2,05mM), XO (140,19mU/mL), NBT (0,43mg/mL). Volumen final: 4,28mL. Procedimiento Sobre una placa de TLC de 45cm2 se sembraron puntos con 0,5μg/punto de alopurinol. Una vez secas las siembras por evaporación bajo corriente de aire a T amb., la placa se roció con una solución 1,5mM de xantina. Luego del rociado de sustrato, sin dejar secar completamente la placa, se procedió al rociado de los 4,28mL de solución reveladora sobre la misma. La placa se situó en una cámara húmeda a 28°C 30 minutos, en la oscuridad. Variantes de este ensayo en cuanto al agregado de NBT: (a) 900μL de NBT 1.86mg/mL fueron rociados sobre la placa en un paso posterior al rociado de sustrato y (b) 900μL de NBT 1.86mg/mL fueron rociados sobre la placa en un paso posterior a los 30 minutos de la reacción enzimática de la XO. 3.6.b Autografía enzimática XO/NBT: sistema inmovilizado por atrapamiento en gel Solución reveladora Agar o agarosa LGT se disolvieron a 80ºC en una solución compuesta por buffer fosfato, EDTA. La solución resultante se enfrió hasta 55ºC. A esta temperatura se agregó NBT, se mezcló por inversión suave y se dejó enfriar hasta 50ºC. A esta temperatura se agregó XO y se mezcló nuevamente por inversión suave. Concentraciones finales: agar o agarosa (0,9% P/V), buffer fosfato pH 7,90 (50,69mM), EDTA (1,01mM), NBT (0,21mg/mL), XO (69,12mU/mL). Volumen final: 8,68mL. Procedimiento Sobre una placa de TLC de 45cm2 se sembraron varios puntos con 0,5μg/punto de alopurinol, como referencia. Una vez secas las siembras por evaporación bajo corriente de aire a T amb., la placa se roció con una solución 1,5mM de xantina. Luego del rociado de sustrato, sin dejar secar completamente la placa los 8,68mL de solución reveladora, a una temperatura de 50ºC, se distribuyeron sobre toda la superficie de la placa de TLC de manera de generar una capa de espesor uniforme. Una vez gelificado en la oscuridad, la placa se mantuvo en cámara húmeda a 28°C 30 minutos, en la oscuridad. Variante del ensayo: una vez que la placa de TLC (sin rociar previamente con sustrato) estuvo cubierta por el gel de espesor homogéneo, todo el sistema se sumergió en una solución de xantina 1,5mM y se mantuvo a 28°C por 30 minutos para permitir que proceda la reacción enzimática. 3.7 Autografía no enzimática NADH/PMS/NBT: sistema inmovilizado por atrapamiento en gel Solución reveladora El agar se disolvió a 80ºC en una solución compuesta por buffer fosfato, EDTA . La solución resultante se enfrió hasta 55ºC. A esta temperatura se agregó NBT y NADH mezclando por inversión suave. Concentraciones finales: agar (0,9% P/V), buffer fosfato pH 7,90 (50,69mM), EDTA (1,01mM), NBT (0,21mg/mL) y NADH (0,114mg/mL). Volumen final: 8,68 mL. Procedimiento Sobre una placa de TLC de 45cm2 se sembraron puntos con 0,5μg de alopurinol en cada uno y paralelamente a los puntos de alopurinol se sembraron en la misma placa iguales cantidades de catequina y taxifolina, como referencias. Una vez que secas las siembras por evaporación bajo corriente de aire a T. Amb., los 8,68mL de solución reveladora, a una temperatura 55ºC, se distribuyeron sobre toda la superficie de la placa de TLC de manera de generar una capa de espesor uniforme. Una vez gelificado en la oscuridad la placa se sumergió en una solución 2,7μM de PMS a T. Amb. 30 minutos, en ausencia de luz. 3.8 Autografía no enzimática RIBOFLAVINA/LUZ/NBT: sistema inmovilizado por atrapamiento en gel. Solución reveladora El agar se disolvió a 80ºC en una mezcla compuesta buffer fosfato, EDTA. La solución resultante se enfrió hasta 55ºC. A esta temperatura se agregó NBT y riboflavina mezclando por inversión suave. Concentraciones finales: agar (0,9% P/V), buffer fosfato pH 7,90 (50,74mM), EDTA (1,01mM), NBT (0,21mg/mL) y riboflavina (0,0124mg/mL). Volumen final: 8,67 mL. Solución reveladora Sobre una placa de TLC de 45cm2 se sembraron puntos con 0,5μg de alopurinol en cada uno y paralelamente a los puntos de alopurinol se sembraron en la misma placa iguales cantidades de catequina y taxifolina, como referencias. Una vez que secas las siembras por evaporación bajo corriente de aire a T. Amb., los 8,67mL de solución reveladora, a una temperatura de 55ºC, se distribuyeron sobre toda la superficie de la placa de TLC de manera de generar una capa de espesor uniforme. Una vez gelificado en la oscuridad la reacción se inició situando la placa a 10cm de una lámpara fluorescente 5 minutos 3.9 Determinación cualitativa del límite de detección para las autografías ensayadas Placas para TLC fueron sembradas en puntos con distintos volúmenes de soluciones 0,2mg/mL y 0,02mg/mL de alopurinol, catequina y taxifolina. De este modo se logró tener sobre la placa cantidades decrecientes de cada uno de los patrones mencionados que abarcaron un rango desde 1x10?4μg hasta 1μg. Las siembras se secaron bajo corriente de aire a T. Amb. antes de proceder al desarrollo de los ensayos autográficos. 3.10 Análisis de mezclas artificiales de compuestos En una placa para TLC Silica gel 60 F254 de 5,5cm x 5,5cm se sembró en la calle I 1µg de alopurinol ; en la calle II, 3µg de catequina; en la calle III, 3µg de taxifolina; y en la calle IV, una mezcla compuesta por las mismas cantidades sembradas por separado de cada uno de los patrones. La elusión fue llevada a cabo con Cloroformo-Acetona-Ácido fórmico en proporciones 5:5:0,1. Una vez terminada la corrida cromatográfica los solventes orgánicos se eliminaron bajo corriente de aire por 30 minutos a T. Amb. previo al desarrollo de los ensayos autográficos. 3.11 Análisis de mezclas naturales de compuestos En una placa para TLC Silica gel 60 F254 de 6cm x 7,5cm se sembró en la calle I, 573µg de extracto de partes aéreas de Galium latoramosum (Horn et Arn) Clos.; en la calle II, 573µg extracto de Galium latoramosum pinchado con 0,2µg de alopurinol (0,03%) y con 6µg de taxifolina (1%); en la calle III, 6µg de taxifolina; en la calle IV, 0,2µg de alopurinol. La elusión fue llevada a cabo con Cloroformo-Acetona-Ácido fórmico en proporciones 7:3:0,2. Una vez terminada la corrida cromatográfica los solventes orgánicos se eliminaron bajo corriente de aire por 30 minutos a T. Amb. previo al desarrollo de los ensayos autográficos. 4 Resultados 4.1 Autografía de XO Una autografía de XO consiste en la separación de una mezcla de compuestos por TLC y en el posterior revelado de la placa con un medio enzimático/colorimétrico. Esto último permite detectar la presencia de determinados compuestos activos presentes en esa mezcla gracias a la disminución de color generada por la ausencia de producto enzimático, Para desarrollar una autografía que permita la detección de compuestos inhibidores de XO es necesario: (a) encontrar la forma de depositar la enzima y el sustrato sobre la placa cromatográfica de modo que la actividad enzimática subsista el tiempo necesario como para producir una cantidad detectable de producto y (b) encontrar reactivos y condiciones que permitan diferenciar colorimétricamente las zonas de la placa con actividad enzimática de aquellas zonas en las que ésta se encuentra disminuida o es inexistente. 4.1.1 Aplicación homogénea de la enzima sobre la placa cromatográfica En el presente trabajo, se probaron dos formas de depositar la enzima sobre la placa cromatográfica: la aplicación de la enzima inmovilizada51 por atrapamiento físico en diferentes geles y la adsorción directa de una solución de la enzima sobre el soporte polimérico de la placa (sílica gel). El atrapamiento en gel es un método de inmovilización en el que la enzima es retenida físicamente en las cavidades interiores de una matriz sólida porosa constituida en nuestro caso por agar o agarosa LGT. El proceso de inmovilización se llevó adelante mediante la suspensión de la enzima en una solución de agar o agarosa LGT en buffer y EDTA, la que se depositó sobre una placa de TLC soporte. Al enfriar el sistema se produce la gelificación de la solución quedando la enzima atrapada en el interior de la matriz generada. Para la aplicación de la enzima por adsorción directa sobre sílica gel, una solución de de la enzima (en una mezcla de buffer y EDTA) se roció en cantidad suficiente sobre una placa de TLC. 4.1.2 Detección de la actividad enzimática. La actividad XO puede ponerse de manifiesto, entre otras formas, a través de reacciones colorimétricas que involucren alguno de los productos generados cuando la enzima XO oxida a la xantina a ácido úrico con la concomitante producción de O2.- y H2O2. Se ensayaron distintos métodos con el objeto de detectar cada uno de los productos de reacción mencionados: el reactivo fosfo-litio-túngstico (para ácido úrico),53,54 el colorante redox NBT (para O2.-) y el sistema peroxidasa/4-aminofenazona/fenol (para H2O2). La efectividad de cada uno de los métodos de detección se probó usando como referencia, al inhibidor de XO, alopurinol. 4.1.2.a Detección de la producción de ácido úrico Para detectar la producción de ácido úrico se probó el reactivo fosfo-litio-túngstico. Éste es un reactivo incoloro que, en un medio fuertemente alcalino, convierte al ácido úrico en alantoína produciendo azul de tungsteno de acuerdo con la Ecuación 1.55 El azul de tungsteno producido es el responsable de la coloración azul del medio de reacción. Dado que no encontramos información sobre el acoplamiento de este método de detección con el sistema generador de ácido úrico Xantina-XO, en principio se analizó si xantina o algún otro componente de la mezcla de reacción interferían con la reacción de detección colorimétrica. Para esto se revelaron con el reactivo fosfo-litio-túngstico, soluciones de los diferentes componentes de la mezcla de reacción enzimática en ausencia de ácido úrico, y soluciones que contenían mezclas de distintos componentes de la reacción enzimática con ácido úrico. Las soluciones que contenían ácido úrico, solo o mezclado con los componentes de la reacción enzimática se colorearon de azul mientras que las soluciones de los diferentes componentes de reacción en ausencia del testigo de ácido úrico permanecieron incoloras. De esto se concluyó que el método permite revelar inequívocamente ácido úrico en solución acuosa, en presencia de los componentes necesarios para que la reacción enzimática se lleve a cabo. Con el objeto de analizar el efecto de la sílica gel de la placa cromatográfica sobre la reacción de coloración se sembraron cantidades decrecientes de ácido úrico patrón en una placa para TLC. La placa posteriormente fue revelada a través del rociado con una solución de Na2CO3 seguida por una solución del reactivo fosfo-litio-túngstico observando coloración azul en los puntos de siembra que contenían una cantidad de ácido úrico igual o mayor a 5,55μg/cm2. La detección de ácido úrico fue más eficiente cuando se dejó secar la siembra a T. Amb. antes de proceder al revelado. Para que XO transforme xantina en ácido úrico, es necesario mantener al medio en un rango de pH de 7,00-8,00, sin embargo, la reacción de coloración con el reactivo fosfo-litio-túngstico suele realizarse a un pH mucho más alcalino, cercano a 11,5. Para probar si la reacción de coloración puede efectuarse a pH más bajo se llevó a cabo el revelado con reactivo fosfo-litio-túngstico de una solución patrón de ácido úrico en un medio buffer fosfato de pH 7,90. En esas condiciones no se produce coloración alguna; sin embargo, cuando ésta misma solución es alcalinizada con Na2CO3, la coloración azul aparece. Entonces, si bien como se demostró con anterioridad, los componentes de la mezcla enzimática generadora de ácido úrico no afectan a la reacción de color, las condiciones en las que ambos procesos se producen son incompatibles. Esto hace que sea necesario separar en el tiempo la producción de ácido úrico, de la reacción del mismo con el revelador fosfo-litio-túngstico. Se roció entonces una placa cromatográfica, previamente sembrada en varios puntos con 2,5μg/punto de alopurinol, con una solución de xantina y luego con una solución de XO en buffer fosfato y EDTA. La placa fue situada en una cámara húmeda a 28°C 30 minutos para permitir que proceda la reacción enzimática. Transcurrido ese tiempo se llevó a cabo el revelado rociando la placa con una solución de Na2CO3 y luego con una solución del reactivo fosfo-litio-túngstico. Al término de algunos minutos, la superficie de la placa cromatográfica se vuelve de color azul en tanto que las zonas en las que se había sembrado previamente alopurinol se mantienen incoloras. Desafortunadamente las zonas de inhibición producidas por alopurinol resultaron casi siempre difusas y en muchos casos difícilmente detectables, lo que restaría potencial a esta metodología a la hora de detectar compuestos inhibidores de la actividad presentes en una mezcla. Con el objeto de aumentar la resolución del ensayo se intentó revelar la presencia de ácido úrico generado por la XO inmovilizada en un gel constituido por agar o agarosa LGT. Para ello se roció con una solución de xantina una placa cromatográfica previamente sembrada en varios puntos con 2,5μg/punto de alopurinol. Luego se depositó sobre la placa una solución de agar conteniendo XO en buffer fosfato y EDTA. Cuando la solución estuvo gelificada, la placa se situó en una cámara húmeda a 28°C en la que permaneció durante unos 30 minutos para permitir que proceda la reacción enzimática. Transcurrido ese tiempo se llevó a cabo el revelado sumergiendo la placa en una solución de carbonato y posteriormente en una solución del reactivo fosfo-litio-túngstico. Desafortunadamente se observó que el reactivo fosfo-litio-túngstico reacciona tanto con el agar como con la agarosa utilizados como agentes gelificantes, produciendo la desintegración del gel el cual adquirió una coloración blanquesina. Este hecho hace imposible utilizar este método de detección de actividad XO conjuntamente con el modo de inmovilización de la enzima en geles de agar o agarosa. 4.2.2.b Detección de la actividad enzimática a través de la detección de la producción de peróxido de hidrógeno La detección de la producción de H2O2 se basó el método Trinder.56 Se utilizó un sistema enzimático en el cual una peroxidasa (POD) reduce H2O2 en presencia de fenol y de 4-aminofenazona (4-AF) (ambos incoloros), de acuerdo con la ecuación 2. La quinona generada es la responsable de la coloración rosa del medio de reacción. Entonces se roció una placa cromatográfica, previamente sembrada en varios puntos con 2,5μg/punto de alopurinol, con una solución de xantina y luego con una solución de XO en buffer fosfato y EDTA. La placa fue situada en una cámara húmeda a temperatura de 28°C en la que permaneció durante unos 30 minutos para permitir que proceda la reacción enzimática. Transcurrido ese tiempo se roció la placa con una solución reveladora de peróxido (POD, fenol y 4-AF). Luego de esperado el tiempo de reacción la superficie de la placa se coloreó de rosa pálido, sin embargo, los halos de inhibición de XO fueron casi inexistentes y desaparecieron ante cualquier intento de concentrar los reactivos de revelado sobre la placa (rociando varias veces) dando una coloración homogéneamente rosada sobre toda la superficie aplicada. Como una alternativa, se recurrió al método de inmovilización por atrapamiento en geles de la XO. Para ello se roció con solución de xantina una placa cromatográfica. previamente sembrada en varios puntos con 2,5μg/punto de alopurinol. Luego se depositó sobre la placa una solución de agar conteniendo XO y POD en buffer fosfato y EDTA. Una vez gelificada la solución sobre la placa, todo el sistema fue situado en una cámara húmeda a 28°C donde permaneció durante unos 30 minutos para permitir que proceda la reacción enzimática de la XO. Luego de ese tiempo la placa se sumergió en la solución de fenol y 4-AF para dar inicio a la reacción de revelado de peróxido por la POD. Los resultados fueron los mismos que para el método directo de inmovilización. Los halos de inhibición poseían muy poco contraste con respecto al fondo rosa. Y desaparecieron completamente cuando se prolongó el tiempo en el que la placa estuvo inmersa en la solución de fenol y 4-AF. 4.2.2.c Detección de la actividad enzimática a través de la detección de la producción de superóxido Para detectar la producción de O2.- se probó el colorante redox NBT. Éste es un reactivo amarillo que reacciona con O2.- produciendo una sal de formazán color violeta de acuerdo con la ecuación 3. La sal de formazán producida es la responsable de la coloración violeta del medio de reacción. En primera instancia, se intentó revelar la presencia del O2.- producido cuando la XO fue depositada directamente sobre la placa para TLC. Para ello primero se roció con una solución de xantina una placa cromatográfica previamente sembrada con alopurinol. Posteriormente la placa se roció con una solución de XO en buffer fosfato, EDTA y NBT, y se mantuvo en cámara húmeda 30 minutos para permitir que proceda la reacción enzimática. El resultado fue negativo, dado que no se visualizó el color violeta esperado en ninguna parte de la superficie de la placa. Con el objeto de favorecer la reacción entre el radical anión superóxido y el NBT, se probaron procedimientos alternativos en los que la solución de NBT fue rociada sobre la placa antes que la enzima, y también luego de los 30 minutos de reacción enzimática. Todas estas variantes del ensayo produjeron los mismos resultados negativos. Como una alternativa, se recurrió al método de inmovilización por atrapamiento en geles de la XO. Para ello se impregnó una placa cromatográfica, previamente sembrada en varios puntos con 2,5μg/punto de alopurinol, con una solución de xantina. Luego se depositó sobre la placa una solución de agar conteniendo XO en buffer fosfato, EDTA, y NBT. Cuando la solución estuvo gelificada la placa se situó en una cámara húmeda a 28°C durante 30 minutos para permitir que proceda la reacción enzimática. Transcurrido ese tiempo se observaron sobre la placa halos de inhibición de XO como puntos claros en una matriz violeta. Inicialmente la reproducibilidad del ensayo se vio afectada por una falta de homogeneidad de la coloración violeta sobre la placa, presumiblemente debida a una accesibilidad despareja a la enzima por parte del sustrato. Se recurrió entonces a un cambio en el orden de los pasos del ensayo que consistió en suministrar el sustrato en solución luego de la gelificación de la solución enzimática sobre la placa. Una vez que la placa de TLC está cubierta por el gel de espesor homogéneo, se sumergió en una solución de xantina y todo el sistema se mantuvo a 28°C por 30 minutos. La reacción enzimática se inicia cuando la xantina difunde desde el seno de la solución al interior del gel entrando en contacto con la enzima. De esta manera se logró una coloración violeta homogénea que permite detectar con claridad la presencia de alopurinol. La siembra de cantidades decrecientes de compuesto sobre la placa permitió estimar la mínima cantidad de inhibidor de XO necesaria para poder observar sin problemas un halo de inhibición. Para el alopurinol esa cantidad fue de 5ng. Para ciertos compuestos flavonoides usados como referencia, como la catequina, y taxifolina dicha cantidad fue aproximadamente de 0,13μg. 4.2 Autografías no enzimáticas En el último ensayo comentado, la actividad enzimática de la XO inmovilizada en un gel es evidenciada una vez que el O2.-generado por la enzima reacciona con el NBT (amarillo) para dar una sal de formazán (violeta). Esto implica que aquellos compuestos que tengan la capacidad de ser captadores de O2.- quedarán evidenciados también como una mancha clara en un fondo violeta al igual que los inhibidores puros de XO. En este caso la mancha observada no correspondería a una real disminución de la actividad enzimática sino a una disminución de la cantidad de O2.- en el medio de reacción. Para resolver esto se procedió al desarrollo de un segundo ensayo sobre TLC en el cual el O2.- fue generado químicamente, de modo de poder diferenciar compuestos captadores de radicales libres de inhibidores puros de XO. Para la generación no enzimática de O2.- se ensayaron dos sistemas: (a) NADH/PMS,57 y (b) Riboflavina/luz.58 Durante el desarrollo de las autografías no enzimáticas se utilizaron como controles el inhibidor de la XO alopurinol y dos captadores de radicales libres, catequina y taxifolina. Para la autografía utilizando el sistema NADH/PMS se sembraron en una placa para TLC varios puntos de 2,5μg/punto de catequina, taxifolina y alopurinol. Luego se depositó sobre la misma una solución de agar conteniendo XO en buffer fosfato, EDTA, NADH y NBT. Cuando la solución estuvo gelificada la placa completa se sumergió en una solución de PMS en buffer fosfato para iniciar la reacción química. Todo el sistema se mantuvo a temperatura ambiente por algunos minutos para permitir que proceda la reacción. Los resultados fueron positivos: las placas mostraron halos de captación del O2.- como puntos claros en una matriz violeta. Una variante infructuosa del experimento, consistió en intentar revelar con NADH el gel conteniente de la XO, NBT y PMS en buffer fosfato. El sistema riboflavina/luz es otra manera no enzimática de generar O2.-.58,59 La formación de O2.- se produce por una descomposición iniciada por exposición a luz fluorescente de una solución de riboflavina. Este sistema se debe acoplar con un método de detección de O2.-, el que se empleó fue el reactivo NBT. Para la autografía se sembró una placa para TLC con varios puntos de 2,5 g/punto de catequina, taxifolina y alopurinol. Luego se depositó sobre la misma una solución de agar conteniendo XO en buffer fosfato, EDTA, riboflavina y NBT. Cuando la solución estuvo gelificada la placa completa se expuso a la luz de un tubo fluorescente para iniciar la reacción química generadora de O2.-. En este sistema los resultados también fueron positivos, o sea las placas mostraron una matriz violeta con halos claros de captación del O2.- correspondientes a los puntos de siembra de catequina y de taxifolina. La siembra de cantidades crecientes de catequina y taxifolina sobre la placa permitió estimar la mínima cantidad necesaria para poder observar sin problemas un halo. Para ambos flavonoides esa cantidad fue aproximadamente de 0,13μg. 4.3 Utilización de ensayos autográficos para la diferenciación de las actividades inhibitorias de XO y captadoras de radical anión superóxido Para diferenciar los compuestos analizados en cuanto a si tienen actividad captadora de radical anión superóxido o actividad inhibitoria de XO se recurrió a la comparación del patrón de manchas que presenta cada uno en una autografía enzimática con respecto al que presenta cada uno en una no enzimática. Se revelaron entonces, utilizando ambos tipos de autografía dos placas de TLC iguales sembradas con catequina, taxifolina, y una mezcla de ellos y corridas en un solvente adecuado. La bioautografía enzimática se llevó a cabo inmovilizando la enzima en un gel de agar, con NBT como revelador de la actividad enzimática e iniciando la reacción por inmersión del gel en una solución de sustrato. En este experimento tanto los dos captadores de O2.- catequina y taxifolina como el inhibidor de XO alopurinol generaron la aparición de zonas claras sobre un fondo violeta. La autografía no enzimática se realizó utilizando el sistema riboflavina/luz. Esta autografía permitió detectar solamente la presencia de los dos flavonoides captadores de radicales libres mientas que el alopurinol no produjo la aparición de ninguna zona clara. Los extractos vegetales contienen un alto número de constituyentes, característica que los convierte en una fuente valiosa de nuevas moléculas con actividad biológica. Estos constituyen matrices complejas en las cuales puede haber un compuesto con la actividad deseada entre muchos otros que no la tienen. El desarrollo de autografías sencillas apunta a tratar de adjudicar la actividad observada en una mezcla al/los componente/s responsable/s de la misma sin tener que aislarlo/s de esa mezcla. Se evaluó, entonces, la aplicabilidad de ambos tipos de autografías puestas a punto (enzimática y no enzimática), en la localización de compuestos activos en una matriz compleja y en la diferenciación del tipo de actividad. Para ello se utilizó un extracto vegetal inactivo, pinchado con cantidades conocidas de alopurinol (0,03% p/p) y taxifolina (1% p/p). Como matriz se utilizó un extracto de partes aéreas de Galium latoramosum (Horn et Arn) Clos. el cual tiene un IC50 mayor a 500µg/mL para actividad XO y captadora de O2.-.60 El extracto, el extracto pinchado y los patrones de referencia se sembraron en una placa de TLC la cual se eluyó con un sistema de solventes adecuado. Luego las placas se revelaron a través de ambas autografías siguiendo los mismos procedimientos descriptos para el análisis de mezclas artificiales. La autografía de XO mostró claramente la presencia de alopurinol y taxifolina mientras que la autografía de riboflavina mostró solamente la presencia de captadores de O2.- . 5 DISCUSIÓN 5.2 Desarrollo de un nuevo ensayo autográfico para detectar inhibidores de XO La enzima XO se mantiene activa sobre placas cromatográficas al ser aplicada por cualquiera de las maneras probadas dado que fue posible revelar la presencia de algunos de los productos de reacción tanto cuando la enzima fue rociada sobre la placa como cuando ésta se depositó inmovilizada en diferentes geles. Ambos métodos de aplicación de la enzima mostraron diferentes características respecto de su utilidad para la autografía. La aplicación directa por adsorción sobre placa resultó en general más fácil desde el punto de vista experimental, sin embargo presentó halos de inhibición enzimática bastante difusos, en comparación con el método de inmovilización en geles. Por el contrario, el método de inmovilización en gel de la enzima, produjo halos más definidos. Esto quizá se deba a cierta restricción en la difusión de los productos. El uso de geles, presenta la ventaja adicional de permitir un mejor procesamiento de los resultados. Los geles pueden ser extraídos de la placa de TLC soporte y digitalizados en condiciones óptimas de contraste entre los halos generados y la matriz coloreada, lográndose límites de detección más bajos. Esto tiene principal importancia cuando los compuestos bajo análisis poseen algún tipo de coloración que ponen en duda la presencia de un halo de ausencia de producto. En cuanto a esta técnica de inmovilización en geles, cabe mencionar que la temperatura demandada cuando se trabaja con agar no representa un problema para la enzima. Esto pudo comprobarse comparando los geles de agar con los geles de agarosa LGT y visualizando la similitud que presentaban los mismos cuando se evidenció la actividad enzimática a través de reacciones colorimétricas con alguno de los productos generados. Aunque de acuerdo a esto cualquiera de los agentes gelificantes serían adecuados para trabajar, utilizando agar en lugar de agarosa se obtuvieron halos más definidos y una matriz más homogénea, sumando así indirectamente otra desventaja, además del costo, a la utilización de agarosa como agente gelificante para estos ensayos. Los tres métodos utilizados para revelar actividad enzimática sobre la placa fueron a priori capaces de hacerlo, sin embargo su utilidad para el desarrollo de un ensayo autográfico confiable fue muy variable. La utilización del reactivo fosfo-litio-túngstico permitió el revelado de ácido úrico producido por el sistema xantina/XO aplicado por rociado sobre una placa cromatográfica produciendo una coloración azul. Si bien la coloración producida fue suficiente como para detectar la presencia de alopurinol adsorbido sobre la placa, el cual se visualizó por producir zonas de menor coloración, el contraste entre las zonas de actividad enzimática (coloreadas de azul) y las zonas de inactividad enzimática (azul pálido) fue muy pobre. La falta de contraste podría deberse a la difusión de los reactivos facilitada por los sucesivos rociados realizados durante el procedimiento completo; sin embargo estos rociados son necesarios debido a que el proceso de generación de ácido úrico no puede coexistir con el proceso de revelado por diferentes incompatibilidades (carácter desnaturalizante del reactivo revelador, rangos de pH necesarios para los dos procesos). Los intentos de utilizar un sistema generador de ácido úrico inmovilizado en geles no fueron exitosos debido a que el reactivo revelador del producto reacciona con los agentes gelificantes. Sin embargo, consideramos que el estudio de la utilidad de este método de tinción para el desarrollo de un ensayo autográfico merece ser profundizado dado que permitiría la detección de inhibidores de XO de manera menos ambigua que la detección de radical anión superóxido. En contraste, el uso del método de POD/4-AF/fenol no resulta tan promisorio. El mismo produjo una coloración rosa pálido sobre la superficie de la placa lo que sugiere la detección de actividad enzimática a través de la coloración producida por revelado colorimétrico del peróxido de hidrógeno generado. Sin embargo, los halos de inhibición de XO producidos por alopurinol fueron prácticamente indetectables y desaparecieron ante cualquier intento de concentrar los reactivos de revelado sobre la placa dando una coloración rosada homogénea sobre toda la superficie aplicada. Esta falta de contraste fue una constante para este método tanto cuando la enzima se aplico por rociado como cuando se utilizaron geles. En los experimentos en los que se intentó detectar actividad enzimática a través del revelado de O2.- con NBT se encontró que una variable importante fue la forma en que se aplicó la enzima. Cuando la XO se aplicó por rociado directo sobre la superficie de la placa cromatográfica el resultado fue negativo, es decir, no se observó la coloración violeta esperada. Sin embargo, cuando la enzima se aplicó atrapada en un gel de agar o de agarosa fue posible detectar actividad enzimática. Luego de probar diferentes protocolos los mejores resultados se obtuvieron cubriendo la placa cromatográfica con una capa de agar conteniendo XO y NBT. Una vez que el sistema solidifica, se pone en contacto con una solución de xantina para iniciar la reacción. La oxidación enzimática del sustrato produce superóxido el cual reduce la sal de tetrazolio (color amarillo pálido) a formazán (violeta oscuro) resultando en la coloración del gel. La presencia de un inhibidor se visualiza como un punto claro en una matriz violeta oscura. De esta manera es posible detectar alopurinol en cantidades de hasta 5 ng. Dado que este método produce la detección de la actividad enzimática a través del revelado de la presencia de radical anión superóxido, compuestos captadores de O2.- competirán con el NBT para dar zonas incoloras que podrían resultar en falsos positivos. Para resolver esto se procedió al desarrollo de una segunda autografía en condiciones similares pero con la diferencia que el O2.- fue generado químicamente, de modo de poder diferenciar compuestos captadores de radicales libres de inhibidores puros de XO. Los dos sistemas no enzimáticos generadores de O2.-probados (riboflavina/luz y NADH/PMS) dieron resultados positivos, sin embargo resultó más sencilla la utilización del sistema Riboflavina/Luz. Usando paralelamente ambos ensayos (xantina/XO y riboflavina/luz) es posible diferenciar a los inhibidores puros de XO (que generan halos de inhibición solo en el ensayo enzimático) de los captadores de radical anión superóxido (que generan halos de inhibición en ambos ensayos). De esta manera es posible detectar la presencia de uno o más inhibidores de XO o captadores de O2.- en mezclas complejas sin separación previa de los componentes. Esto se demostró al aplicar el ensayo para la detección de alopurinol y de taxifolina en una matriz compleja aportada por un extracto previamente pinchado con ambos compuestos. Cabe mencionarse que el uso en combinación de ambas bioautografías no permite la distinción clara de compuestos que son inhibidores de XO y además captadores de radicales libres con respecto a compuestos que sólo son captadores de radical anión superóxido. 5 CONCLUSIONES - La presencia de compuestos inhibidores de XO presentes en mezclas puede detectarse utilizando el ensayo autográfico desarrollado basado en la aplicación de la enzima inmovilizada en un gel de agar y en la detección de actividad enzimática a través del revelado de O2.- producido con NBT. - La presencia de compuestos captadores de O2.- presentes en mezclas puede detectarse utilizando el ensayo autográfico desarrollado basado en la generación no enzimática de este radical y el cual es revelado con NBT. - La utilización de ambos ensayos permite una discriminación preliminar entre compuestos que posean una o la otra actividad.