Desarrollo de un método bioautográfico sobre placa cromatográfica para la detección de inhibidores de Xantina Oxidasa.

RAMALLO, IA; ZACCHINO, SA; FURLAN, RLE

Rosario

Otro; XXIII Reunión Anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2003

Sociedad de Biología de Rosario

Los extractos de origen vegetal representan una de las fuentes más importantes de nuevos compuestos con potencial. Dado que éstos son mezclas complejas de compuestos químicos, el hecho de encontrar un extracto con la actividad deseada representa solamente el comienzo de un largo y tedioso proceso de fraccionamiento que es más costoso que la preparación misma del extracto. Esto hace necesario el desarrollo de bioensayos sencillos que permitan adjudicar la actividad observada en una mezcla al/los componente/s responsable/s de la misma antes de ser separados, de manera de guiar el fraccionamiento. Una forma de lograr este objetivo es combinando un método separativo simple como la cromatografía en capa delgada (TLC) con un ensayo bioautográfico. Hasta el momento existen solo dos reportes de bioautografías enzimáticas sobre TLC, ambos utilizando a la enzima acetilcolinesterasa para detectar potenciales inhibidores de la misma. Este trabajo tiene como objetivo el desarrollo de un método bioautográfico sobre TLC para detectar inhibidores de la enzima Xantin Oxidasa (XO), catalizadora de la formación de ácido úrico en nuestro organismo. Dado que la acumulación de ácido úrico produce la patología conocida como gota, ésta es tratada con agentes uricosúricos o con inhibidores de XO. El único inhibidor de XO de uso clínico actual es el alopurinol que ha sido asociado con casos de hipersensibilidad severa por lo que resulta importante encontrar inhibidores alternativos. Para el desarrollo de la metodología se utilizaron placas cromatográficas de Aluminio cubiertas con Silica Gel GF 254 sembradas con cantidades crecientes de alopurinol como control positivo. Las mismas fueron cubiertas con XO en solución buffer o inmovilizada en diferentes agentes gelificantes. Para la detección de actividad enzimática se probaron diferentes reveladores químicos o enzimáticos de ácido úrico  (reactivo fosfo-litio-túngstico), de radical superóxido (cloruro de p-nitrotetrazolio azul, NBT) y de peróxido de hidrógeno (peroxidasa-fenol-4-aminofenazona). La reacción se inició en todos los casos por adición de Xantina como sustrato. Los mejores resultados se obtuvieron cubriendo la placa cromatográfica con una capa de agar conteniendo XO y NBT, colocando posteriormente el sistema en contacto con una solución de xantina e incubando a 35 °C por 20 minutos. En estas condiciones la presencia del inhibidor se visualiza como un punto blanco en una matriz azul y el límite de detección del método para alopurinol es de 0.01 mg. El bioensayo descripto es rápido, sencillo y permite el análisis de varias muestras al mismo tiempo sin grandes requerimientos de equipamiento. Estas características lo hacen interesante como método para la dereplicación de extractos vegetales.