Combinación de estrategias metabólicas para la producción de antraquinonas en suspensiones celulares de Rubia tinctorum

PERASSOLO, M.; GIULIETTI, A.M.; RODRÍGUEZ TALOU, J.

Simposio; II Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2012

Introducción: El reino vegetal constituye una fuente de productos naturales, incluyendo a los metabolitos secundarios. Debido a sus variadas propiedades terapéuticas, estos compuestos tienen una gran aplicación en la industria farmacéutica y cosmética, entre otras. La obtención de este tipo de compuestos a partir de cultivos in vitro resulta una alternativa promisoria frente a la extracción de los mismos de su fuente natural, ya que presenta ventajas interesantes, tales como la posibilidad de obtener productos de calidad homogénea así como también evita la explotación de los recursos naturales. Si bien uno de los principales inconvenientes de la producción de metabolitos secundarios suele ser su bajo rendimiento, este tipo de cultivos permite la aplicación de estrategias para aumentar su acumulación y/o su purificación. Una de estas estrategias es la elicitación, la cual se ha aplicado con considerable éxito con el fin de favorecer la acumulación de estos compuestos, ya sea empleando componentes celulares de un patógeno, agentes físicos o químicos, o elicitores endógenos como el Metil jasmonato (MeJ). Por otra parte, las ciclodextrinas (CD) han sido empleadas en la industria farmacéutica, biotecnológica y de alimentos con diversos fines, siendo uno de ellos favorecer la acumulación de metabolitos secundarios. Recientemente, se ha demostrado que no sólo tienen un efecto elicitor en cultivos in vitro, aumentando la producción dichos metabolitos, sino que también favorecen su liberación al medio de cultivo. Las antraquinonas (AQs) son un grupo de metabolitos secundarios producidos por Rubia tinctorum que han sido utilizados tradicionalmente como tinturas. Además, se ha reportado que poseen propiedades terapéuticas interesantes tales como actividad antileucémica, antimalárica, antifúngica y antioxidante, entre otras. El objetivo del presente trabajo fue estudiar el efecto del tratamiento con MeJ y con dos CD, hidroxipropil-b-ciclodextrina (HPCD) y metil-b-ciclodextrina (MCD) en la producción de AQs en suspensiones celulares de R. tinctorum. Metodología: Las suspensiones de R. tinctorum fueron subcultivadas en medio Gamborg B5, adicionado con: sacarosa (20 g/L), ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2 mg/L), ácido indolacético (0,5 mg/L), ácido naftalenacético (0,5 mg/L) y kinetina (0,2 mg/L); pH final: 5,75-5,80. Se realizaron dos ensayos con diseño factorial completo, combinando el agregado de MeJ con cada una de las CD mencionadas (Tabla 1). Se analizó la biomasa producida por el método de peso fresco y se realizó la determinación espectofotométrica del contenido de AQs, tanto a nivel extracelular como intracelular. En este último caso, la determinación se realizó previa extracción hidroalcohólica a 80ºC. Resultados: En el ensayo de HPCD-MeJ, se encontró que al evaluar el contenido intracelular de AQs, ambas variables (MeJ y HPCD) presentaban interacción significativa tanto a los 3 como a los 5 días post-elicitación, por lo que se procedió a analizar los efectos simples de cada una de ellas. En ausencia de HPCD, se evidenció un aumento significativo en el contenido intracelular de AQs en respuesta al MeJ, tanto a los 3 como a los 5 días post-elicitación (68 y 71%, respectivamente). En presencia de la CD, el agregado de MeJ resultó en aumentos del 160%, tanto a los 3 como a los 5 días post-elicitación. Con respecto a los efectos simples de la HPCD, la concentración intracelular de AQs no se vio afectada por esta CD en ausencia de MeJ, mientras que en presencia del elicitor el contenido de AQs aumentó significativamente tanto a los 3 como a los 5 días post-elicitación (70 y 37%, respectivamente). También se evaluó el efecto de ambos compuestos sobre el contenido extracelular de AQs. En estos ensayos, se encontró que si bien la HPCD provocó una liberación de antraquinonas al medio de cultivo, esta liberación no fue tan significativa como la reportada por otros autores (de 1,25% sin HPCD a 2,25% en presencia de HPCD, al tercer día de elicitación). Con respecto al ensayo de MCD-MeJ, también se observó interacción significativa entre ambas variables (MeJ y MCD) tanto a los 3 como a los 5 días post-elicitación, por lo que se analizaron los efectos simples de cada una de ellas. El agregado de MeJ en ausencia de MCD produjo incrementos significativos del contenido intracelular de AQs (190 a los 3 y 162% a los 5 días post-elicitación), mientras que en presencia de MCD, los incrementos llegaron a 371 y 312% los 3 y 5 días post-elicitación. Con respecto a los efectos simples de MCD, el contenido de AQs intracelular no varió significativamente en ausencia de MeJ, pero en cambio, en presencia del elicitor, el agregado de MCD resultó en incrementos del 59 y 79 % (3 y 5 días respectivamente). Al analizar el contenido extracelular de AQs, se encontró que el agregado de MCD favoreció la liberación de estos metabolitos al medio de cultivo (181 y 229%, a los 3 y 5 días), mientras que el MeJ no tuvo efecto significativo. Conclusiones: La combinación de estrategias de elicitación y agregado de ciclodextrinas demostró ser una herramienta muy eficaz para aumentar la producción de metabolitos secundarios. En este sentido, se demostró el efecto sinérgico del MeJ y de dos CD en suspensiones celulares de R. tinctorum, alcanzándose incrementos en el contenido intracelular de AQs de hasta 160% para HPCD y 371% para MCD, constituyendo una nueva evidencia de lo observado en otras especies vegetales y otros metabolitos. En el caso de MCD, se evidenció además su efecto favorecedor de la liberación de estos metabolitos al medio de cultivo, lo que facilitaría su recuperación y purificación. Esto demuestra la gran versatilidad y potencialidad que presentan las ciclodextrinas en procesos biotecnológicos.