Caracterización de sistemas CRISPR-Cas en lactobacilos del grupo casei

PUJATO, SILVINA ALICIA; GALLIANI, VALENTINA; BRIGGILER MARCÓ, MARIÁNGELES; QUIBERONI, ANDREA DEL LUJÁN; MERCANTI, DIEGO JAVIER

Buenos Aires

Congreso; XV Congreso Argentino de Microbiología (CAM 2019); 2019

Asociación Argentina de Microbiología

Los sistemas CRISPR (del inglés {ClusteredRegularly Interspaced Short Palindromic Repeats}), presentes en genomas debacterias y arqueas, son arreglos de secuencias de ADN repetitivas, cortas yconservadas (repeticiones), intercaladas con secuencias variables(espaciadores). Estos arreglos se asocian con genes específicos ({cas}), y en conjunto (sistemas CRISPR-Cas) proporcionaninmunidad específica y heredable contra fagos y plásmidos. Estos sistemas seclasifican de acuerdo con el contenido de genes {cas} en 6 tipos (I a VI) y variossubtipos. La especificidad de la inmunidad radica en los espaciadores, cuyasecuencia corresponde a segmentos de ADN de agentes invasores adquiridos durantecontactos previos. Un sistema activo debe poseer genes {cas}, ya que estosmedian la adquisición de espaciadores y el proceso efector de la inmunidad. Apesar de la creciente popularidad de CRISPR-Cas como herramienta de edicióngenómica, se han caracterizado pocos sistemas endógenos. Por ello, el objetivoplanteado para este trabajo fue detectar, secuenciar y analizar los sistemasCRISPR-Cas completos presentes en 49 cepas de lactobacilos del grupo {casei} dela colección del INLAIN.Con este propósito se diseñaron primers específicos sobresecuencias nucleotídicas conservadas de regiones CRISPR reportadas en genomas delactobacilos del grupo {casei}. Utilizando dichos primers,se verificó por PCR la presencia de sistemas de los tipos IIA en 21 cepas (17 {Lactobacillusparacasei} y 4 {Lactobacillus rhamnosus}) y IE en una cepa de {Lb. paracasei}. Los ampliconesfueron secuenciados (Macrogen, Corea) y a partir de las secuencias obtenidas serepitieron sucesivamente ciclos de diseño de primers, amplificación ysecuenciación, hasta completar los {loci} CRISPR-Cas.El contenido de genes {cas}para lascepas con sistema tipo IIA fue característico: {cas1} y {cas2} (universales,presentes en todos los sistemas CRISPR-Cas), {csn2} (específicos del tipoIIA) y {cas9} (sistemas tipo II).La diversidad de los sistemas CRISPR-Cas se determinó a través de ladistribución filogenética de {cas1}, mientras que lavariabilidad entre los sistemas de tipo II encontrados fue evaluada a través dela alineación de {cas9}. Además, seidentificó un tracrRNA homólogo a los encontrados en los sistemas de tipo II,entre los genes {cas1} y {cas9}. Aunque los genesuniversales fueron conservados, se observó un 22% de polimorfismo denucleótidos para {cas9}. Como era de esperar,el contenido de espaciadores fue variable (entre 10 y 26) entre las cepas. Lacepa con el sistema tipo IE también presentó un contenido de genes {cas} característico: {cas1} y {cas2} (universales), además{cas3} y {cas6e}, los cualesdeterminan que se trata específicamente de este sistema. Los sistemas CRISPR-Cashallados en 21 cepas de {Lb. paracasei} y {Lb. rhamnosus} podrían estar activosya que poseen regiones CRISPR completas. Estudios posteriores de interferencia se utilizaránpara confirmar esta hipótesis.