Expresión de sialato o-acetil esterasas codificadas por profagos Stx2a

PASCAL STEFANÍA; LUCCHESI PAULA M. A.; NIETO FARÍAS M. VICTORIA; KRÜGER ALEJANDRA

Buenos Aires

Jornada; II Jornadas Latinoamericanas de Bacteriófagos; 2022

La producción de toxinas Shiga (Stx), codificada y regulada porbacteriófagos, es el principal factor de virulencia de un grupo de cepas E. coli que pueden causar severas enfermedades enel hombre, como colitis hemorrágica y síndrome urémico hemolítico. Las Stxscomprenden una familia que contiene varios subtipos diferencialmente asociadosa manifestaciones clínicas. Las cepas productoras de la toxina Stx2a sonaltamente virulentas y causan las enfermedades más severas. Los análisisgenómicos de los profagos Stx muestran una considerable variabilidad genética yun alto porcentaje de genes con funciones desconocidas. En estudios de profagosStx2a, se identificó la presencia de un gen que codifica para una sialatoO-acetilesterasa. Esta enzima (NanS-p) presenta un dominio catalítico (SASA)homólogo a la esterasa bacteriana de E. coli (NanS)con actividad frente a los ácidos siálicos, pero además posee un dominioN-terminal (DUF1737) y otro C-terminal. El gen nanS-p se encuentra localizado inmediatamenteaguas abajo del operón stxy aguas arriba de los genesque median la lisis bacteriana. Esta ubicación sugiere que nanS-p está regulado y es cotranscripto conlos genes tardíos del fago. Por ello, el objetivo de este trabajo fue evaluarsi la expresión de estas sialato O-acetilesterasas aumenta bajo condiciones queinducen el ciclo lítico de fagos. Se cuantificó la expresión génica relativa de14 cepas STEC stx2a-positivas utilizando la técnica deqPCR. Por medio de análisis bioinformáticos, se diseñaron primers que permiten la amplificación de la regiónDUF-SASA de subtipos de nanS-p presentes principalmente en profagosStx y se utilizaron primersdescriptos en labibliografía para la amplificación del gen de referencia tufA. Se utilizó ADNc preparado previamente apartir de los cultivos de STEC inducidos (0,5 μg/ml de mitomicina C) y noinducidos, que había sido empleado para determinar la expresión de stx y está conservado a -20°C. Las curvasestándares se realizaron con diluciones seriadas de un pool de muestras de ADNc. Para cada reacción seutilizó 10 μl de FastStart Universal SYBR Green Master Rox (Roche DiagnosticsGmbH) y 4 μl de muestra (ADNc) diluida 1/10. Las reacciones se realizaron en unequipo StepOne Plus Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Los resultadosse analizaron por el método ΔΔCT. Se observó un aumento en la expresión de NanSp bajo tratamiento conmitomicina C,en niveles entre 1 a 2Log. La excepción fue la cepa 355, la cual previamente tampoco había mostradoexpresión de Stx2a. Los resultados obtenidos confirmaron que el gen nanS-p se ve expresado tanto en condiciones queinducen el ciclo lítico como en estado basal y que la expresión de este genaumenta en condiciones que inducen el ciclo lítico. Este aumento ocurre enórdenes de magnitud comparables a stx2a, elcual se encuentra aguas arriba de nanS-p yestá orientado en la misma dirección transcripcional.