Determinación de sexo fetal en plasma materno

GAYDOU L, FOLLONIER A, BOSQUIAZZO VL, RAMOS JG

Congreso; III Congreso Bioquímico del Litoral; 2015

A partir del descubrimiento de la presencia de ADN fetal libre en sangre materna, el diagnóstico prenatal no invasivo se ha convertido en un área de gran interés clínico y se encuentra en pleno desarrollo. La importancia de la determinación del sexo fetal en etapas tempranas de la gestación radica en la posible detección de patologías hereditarias asociadas al cromosoma X ó Y, o la posibilidad de virilización del embrión con déficit de 21-Hidroxilasa, lo que permitirá al médico brindarle al paciente la consejería genética adecuada. La determinación de sexo en sangre materna se realiza evaluando la presencia decromosoma Y. Un resultado positivo indica que el sexo del feto es masculino, en tanto que un resultado negativo nos indica que el feto es femenino. Para realizar estas determinaciones es necesario contar con métodos sensibles que permitan detectar bajas cantidad de ADN fetal en plasma materno. En nuestro país, son escasos los centros que realizan estas determinaciones, lo que conlleva a que se deriven las muestras al exterior y los costos sean elevados.En el presente trabajo nos propusimos desarrollar oligonucleótidos específicos y una técnica sencilla para la detección, por PCR, de sexo fetal en plasma materno. Para ello se utilizaron plasmas de mujeres embarazadas (entre las semanas 13 y 36 de gestación) obtenidos con EDTA. Como controles positivos y negativos se utilizaron muestras de plasma de hombres y mujeres no embarazadas, respectivamente. Las muestras se conservaron a -20°C hasta su procesamiento. El ADN libre se extrajo con las columnas QIAamp DNA blood Mini kit (QIAGEN). Mediante estudios bioinformáticos y utilizando un software adecuado se diseñaron diferentes oligonucleótidos específicos para la detección del cromosoma Y. Se seleccionaron tres pares de oligonucléotidos en función de sus características termodinámicas, dos de los pares seleccionados amplifican diferentesregiones del gen SRY (uno desde la base 4847 a la 4983, y el otro desde la 5305 a la 5422) y el tercer par amplifica una región del gen DYS14. Se pusieron a punto las PCR utilizando los oligonucleótidos diseñados. La especificidad de los amplicones obtenidos se corroboraron por curvas de disociación y posteriormente se verificó el peso molecular de los amplicones mediante corridas electroforéticas en geles de agarosa. Luego, se evaluaron las muestras de ADN libre de mujeres embarazadas y los amplicones obtenidos se sometieron a electroforesis sobre geles de agarosa. Cuando las PCRs se realizaron utilizando los oligonucelotidos para amplificar SRY (4847-4983) y DYS14, se observaronbandas específicas en la muestras de ADN libre que provenían de embarazadas de feto masculino (confirmado por ecografía) mientras que no se observaron bandas en las muestras de embarazadas de fetos femeninos. Los resultados obtenidos utilizando los oligonucleótido SRY (4847-4983) y DYS14 en las muestras evaluadas en el 2° y 3° trimestre de gestación demuestran 100% de especificidad. La utilización de un doble target (SRY y DYS14) en la técnica desarrollada asegura una alta especificidad, próximamente determinaremos cuál es el momento más temprano del embarazo en el cuál se pueda detectar ADN fetal utilizando esta metodología.