Desarrollo de una metodología para la determinación de la carga alélica de la mutación JAK2 V617F.

CARDOZO A, PADUÁN BS, ROSSETTI MF, RAMOS JG, BOSQUIAZZO VL.

Congreso; III Congreso Bioquímico del Litoral; 2015

Mutaciones en el gen JAK2 fueron detectadas inicialmente en síndromesmieloproliferativos crónicos (SMPc) más específicamente en SMPc bcr/abl negativos. La mutación más frecuente observada es G1849T en el exón 14 que resulta en la sustitución V617F en la proteína (JAK2 V617F), dando origen a una proteína con actividad tirosina quinasa constitutiva. Algunos trabajos han demostrado bajos porcentajes (1-3%) de la mutación en individuos sanos lo que sugieren que la misma puede estar presente antes de que se desarrolle el cáncer. Esto crea la necesidad de contar con métodos cuantitativos sensibles y precisos para su detección. En el presente trabajo nos propusimos desarrollar una metodología que permita la determinación cuantitativa de la carga alélica de lamutación JAK2V617F (porcentaje de alelos JAK2V617F/ total alelos JAK2) Utilizando una metodología de PCR alelo específica en tiempo real. Para ello se estudió la secuencia del gen JAK2 y se diseñaron pares de oligonucleótidos determinando las mejores características termodinámicas y discriminatorias entre JAK2 y JAK2V617F, agregando un gap sustitutivo purina-pirimidina en la posición -2 de cada oligonucleótido con el objetivo de aumentar la astringencia de la reacción. Mediante la técnica de fenol-cloroformo-alcohol se extrajo ADN genómico de una muestra de sangre periférica de una persona sana y de lalínea celular establecida HEL proveniente de eritroleucemia humana, portante homocigota de la mutación JAK2V617F. Con los oligonucleótidos diseñados para el gen JAK2 y usando como molde el ADN extraído de sangre periférica se obtuvo el amplímero de JAK2. Con los oligonucleótidos diseñados para el gen JAK2V617F y usando como molde el ADN extraído de la línea celular se obtuvo el amplímero de JAK2V617F. Los amplímeros obtenidos se clonaron direccionalmente en vectores plasmídicos, denominándose pWT y pM, respectivamente. Los plásmidos se linealizaron y se determinaron sus concentraciones por espectrofotometría. Con el objetivo de determinar cuál es la mejor matriz molecular para validar la técnica se realizaron diferentes tipos de curvas de calibrado: a) curvaconstruida con cantidades decrecientes de ADN genómico de paciente sano sobre una concentración constante de pM, b) curva construida con cantidades decrecientes de pM en una cantidad constante de ADN genómico. Los parámetros obtenidos para estas fueron: curva a, pendiente= (-2,87), eficiencia= 125%, límite de detección: 11% de alelos JAK2V617F; curva b, pendiente= (-3,19), eficiencia= 105%, límite de detección: 1% de alelos JAK2V617F. Para la futura determinación de la carga alélica en muestras de sangre periférica se recomienda utilizar curvas de calibrado construida con diluciones de pM sobre una matriz de DNA genómico normal constante. Los resultados obtenidos demuestran quela metodología desarrollada es capaz de detectar bajas cargas alélicas de JAK2V617F (1%) con alto poder discriminativo, lo que permitirá la detección temprana de la mutación en individuos sanos, como así también la evaluación de respuestas a acciones terapéuticas en distintas patologías oncológicas.