DESARROLLO DE REACTIVOS PARA LA DETECCIÓN CUANTITATIVA DEL GEN DE FUSIÓN PML-RARA MEDIANTE PCR EN TIEMPO REAL

BELAVI C; PADUÁN BS; RAMOS JG; BOSQUIAZZO VL

Congreso; III Congreso Bioquímico del Litoral; 2015

El 95% de las leucemias promielocíticas agudas (LPA) se deben a la traslocación cromosómica 15;17 resultando en la fusión génica PML (Leucemia Promielocítica)-RARA (Receptor de Ácido Retinoico Alfa), que codifica una proteína híbrida que bloquea la diferenciación de los promielocitos. Ésta, presenta tres subtipos moleculares según el punto de corte en el gen PML, siendo las variantes bcr1 (breakpointclusterregion) y bcr3 las de mayor frecuencia de aparición. En Argentina no se producen reactivos de diagnóstico in vitro para la detección de estos genes de fusión y los kits utilizados en laboratorios especializados son importados, implicando altos costos, largos tiempos de espera y dificultades logísticas a la hora de realizar estas prestaciones. Nuestro objetivo fue desarrollar reactivos de diagnóstico de base biotecnológica para conformar un kit que permita la cuantificación, mediante PCR en tiempo real delos transcriptos PML-RARA en sus variantes más frecuentes.El mismo incluye: 1) calibradores en distintas concentraciones que se utilizan para la confección de curvas de calibrado, 2) estándares de ARN de alta y baja expresión de los genes de fusión que permiten controlar distintos pasos de la cuantificación, 3) oligonucleótidos y sondas fluorescentes específicos para cada variante de PML-RARA y 4) mixes de reactivos listos para usar durante la etapa de amplificación.Los calibradores consisten de plásmidos recombinantes linealizadosutilizados en distintas concentraciones (rango: 106 - 101 copias/tubo) para la confección de curvas de calibrado. Para su obtención se diseñaron oligonucleótidos específicos y se amplificaron las regiones correspondientes a los genes PML(bcr1), PML(bcr3) y RARA a partir de ADN genómico. Los genes de fusión PML-RARA (bcr1) y (bcr3) se construyeronen forma recombinante, mediante la ligación direccional de sus extremos usando enzimas de restricción específicas y posterior ligación con T4 DNA ligasa. Luego las fusiones se insertaron y clonaron en el vector plasmídicopBluescriptIISK(-). Los plásmidos recombinantes obtenidos se purificaron y linealizaron mediante el corte con una enzima de restricción (BamHI). La cuantificación del número de copias de cada plásmido se realizó por espectrofotometría y se confeccionaron las curvas de calibrado realizando diluciones sucesivas de los mismos.Los estándares consisten en ARN de los distintos genes de fusión en una concentración conocida(105 y 102 copias/tubo) y diluidas en ARN humano normal. Éstos, se desarrollaron a partir de los plásmidos recombinantes mediante transcripción in vitro, utilizando la enzima T7 ARN polimerasa. Su concentración se determinó por espectrofotometría.Las curvas de calibrado obtenidas demostraron linealidad en el rango establecido (106 - 101 copias/tubo)y buenos valores de eficiencia (105,76% y 101,25% para bcr1 y bcr3, respectivamente), mientras que los estándares de ARN de alta y baja expresión generados in vitro demostraron ser estables durante 12 meses y confirmaron su utilidad como control de los pasos de cuantificación. La posibilidad de brindar kits para estas determinaciones en nuestro país tiene la intención de apostar a la sustitución de importaciones de productos médicos, política promovida intensamente en los últimos años, como así también beneficiar al sector de la salud ya que le permitirá disminuir sus costos en análisis clínicos en áreas muy sensibles como la oncohematología.