DETERMINACIÓN EN PLASMA DE LA PROTEASA QUE CLIVA AL FACTOR VON WILLEBRAND (VWFCP)Y SU INHIBIDOR

FARIAS CE, KEMPFER AC

FUNDAMENTOS PARA EL MANEJO PRACTICO EN EL LABORATORIO DE HEMOSTASIA

Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis

Lugar: CABA; Año: 2003; p. 318 - 321

DETERMINACIÓN EN PLASMA DE LA PROTEASA QUE CLIVA AL FACTOR VON WILLEBRAND (VWFCP)Y SU INHIBIDOR Introducción La VWFCP se ha identificado en plasma normal y suero; degrada al VWF en la posición 842-843 de la subunidad (1). In vivo, esta proteasa parece jugar una función crítica regulando el tamaño de los multímeros del VWF para su óptima eficiencia en la adhesión plaquetaria al subendotelio bajo condiciones de alto shear (2) .Tiene un peso molecular de alrededor de 300 kD, es aniónica. Su actividad proteolítica se desarrolla a pH> 7.5. Es inhibida por agentes quelantes. Tiene una vida media de 2-3 días (3). La deficiencia de la VWFCP (ADAMTS 13) es el mecanismo molecular responsable de la púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) (4). Recientemente, Mannucci midió la VWFCP en una población de controles sanos desde recién nacidos hasta gerontes. Los niveles de proteasa son bajos en los recién nacidos, pero se normalizan dentro de los 6 meses. En gente sana, la proteasa disminuye a partir de los 65 años, y en el embarazo está disminuída en los dos últimos trimestres con respecto al primero. En cirrosis, uremia, estados inflamatorios agudos y períodos post-operatorios también se encuentra disminuída (5). La enfermedad hepática, renal y los estados inflamatorios no son inusuales en las microangiopatías trombóticas, pero valores bajos de proteasa en estos estados no significan PTT. Además, la proteasa puede estar disminuída en pacientes con sindrome urémico hemolítico (SUH) y falla renal ó hepática, por lo tanto, esta observación se contrapone con la idea de valores normales de proteasa encontrados en SUH (6,7,8). Remuzzi y col encontraron que la deficiente actividad de ADAMTS13 no distingue entre PTT y SUH, por lo menos en las formas familiares y recurrentes (9). Fundamento de la técnica La proteasa activada con BaCl2 de los plasmas a estudiar actúa sobre el VWF purificado que se altera conformacionalmente por tratamiento con urea. La actividad proteásica sobre el VWF purificado se detecta evaluando los multímeros grandes remanentes del VWF por la técnica de VWF:CB. Materiales y Métodos -Polietilenglicol 4.000 (PEG) droga sólida -Solución de citrato/EDTA (pH 7,4): citrato 55 mM, Na2 EDTA 5 mM. -tampón Tris-glicina (pH 6,8): glicina 2,6 M, ClNa 0,3 M,Tris 25 mM. -ClNa droga sólida - Solución Tris-ClNa (pH 7,4): NaCl 0,15 M, Tris-HCl 10 mM. -BaCl2 0,093 M - Solución de Urea (pH 8,5-9): Urea 1,5 M, Tris 5 mM - NaCl 0.15M, pH 7.4 - EDTA disódico 0,02M. Procedimiento Obtención y preparación de las muestras plasmáticas Se obtiene sangre del paciente en ayunas, en tubos de plástico conteniendo citrato de sodio 129 mM, en proporción 1/10. Se obtiene el plasma pobre en plaquetas (menos de 1000 plaquetas/mL)por centrifugación a 2,500 g durante 20 min a 10°C; el plasma se pasa a otro tubo y se centrifuga nuevamente en las mismas condiciones. Los normales se mezclan para obtener un pool (PNP) de referencia. Preparación del VWF purificado. El plasma normal obtenido en CPD (citrato-fosfato-dextrosa) se mezcla con 1% de PEG, se agita y se congela rápidamente en un baño de hielo seco y alcohol; luego se conserva a ?70°C hasta el momento de usar. El plasma se descongela lentamente a 4°C. Una vez descongelado, se centrifuga a 2100g durante 20 min a 4ºC. El crioprecipitado obtenido se lleva a temperatura ambiente (TA)y se disuelve en 1/25 del volumen inicial del plasma, de tampón citrato/EDTA. Agregar tampón Tris-glicina (concentración final 2M), agitar durante 45 min. Centrifugar durante 15 min a 5.000g, a TA. Agregar NaCl sólido en la proporción : 90,6 g/L de sobrenadante, a TA. Agitar durante 30 min y centrifugar a 5000 g, durante 15 min a TA. Resuspender el precipitado obtenido en 1/50 del volumen original de plasma de tampón citrato/EDTA. Conservar a -70ºC hasta la purificación del VWF. La purificación del VWF se logra por filtración en columna (1,5m x 1,3cm) en gel Sephacryl S-1000, eluyendo con tampón citrato/EDTA a 20ºC. El flujo debe ser de 3 mL/cm2. h colectándo fracciones de 10mL. La localización de VWF en las distintas fracciones se realiza determinando el VWF:RCo en cada tubo. Finalmente la muestra resultante se concentra usando 20 % de PEG 20.000 y se dializa contra 0,15M NaCl, pH 7,2. Luego se almacena a -70ºC (10). Diluciones de las muestras plasmáticas Se construye la curva normal con el PNP desde 1/5 hasta 1/80 en solución Tris-NaCl. Las muestras de plasma de los pacientes se diluyen 1/5 a 1/20 con una solución de Tris-NaCl. Preparación de las muestras para titular el inhibidor (a- VWFCP) Se realizan mezclas de plasma de pacientes y de PNP en partes iguales e incubar a 37ºC durante 30 min. Estas mezclas se utilizarán diluidas 1/5 con tampón Tris-ClNa. Activación de la VWFCP de los plasmas a evaluar A cada una de las diluciones descritas se le agrega BaCl2 0,0176M(concentración final) y se incuban a 37ºC durante 30 min para que se produzca la activación de la VWFCP. Preparación de las muestras con el VWF exógeno Luego de la incubación para activar la VWFCP, se adicionan 36µL de VWF exógeno (concentración final de 1 U/mL) a 148 µL de las diluciones de los plasmas activados en los que se evalúa la VWFCP (6). Cambio de conformación del VWF de las muestras Se realiza por diálisis en solución de urea en membrana diálisis de SIGMA (excluye moléculas menores de 12.000 D) en condiciones estáticas, durante 19 h a 37ºC. Posteriormente, las muestras se dializan 3 h en NaCl 0.15M, pH 7.4 y luego se detiene la reacción con EDTA 0,02M (11) Detección por VWF:CB de la VWFCP y a-VWFCP Se detecta en todas las muestras tratadas respecto a una curva de referencia de PNP desde 1/20 hasta 1/640. Resultados Si la determinación de VWF:CB se realiza por absorciometría, leer a 492 nm y graficar la curva doble log de las diluciones del PNP (la dilución menor de la curva del PNP se considera como 100% de VWFCP) vs. las lecturas de absorbancia e interpolar los datos de los pacientes. Si la determinación de VWF:CB se realiza por citometría de flujo, se construye una curva doble log con las medianas (MD) de fluorescencia de las distintas diluciones del PNP tratado respecto al % de VWFCP Se interpolan los valores de las MD de las muestras incógnitas y se extrapola el % de VWFCP. Se debe considerar el factor de dilución. Comentarios Los valores de VWF:CB de las muestras tratadas respecto al PNP sin tratar, se estiman para verificar la calidad del proceso y de la detección en pruebas sucesivas, pero son innecesarios para la cuantificación pues arbitrariamente se elige el 100% de VWFCP como la dilución menor de la curva de PNP tratado. Bibliografía Dent J, Berkowitz S, Ware J, Kasper C, Ruggeri Z. Identification of cleavage site directing the immunochemical detection of molecular abnormalities in type IIA.Von Willebrand factor. Proc Natl Acad SCI USA 1990; 87: 6306-10. Obert B, Tout H, Veyradier A, Fressinaud E, Meyer D, Girma JP. Estimation of the von Willebrand factor-cleaving protease in plasma using monoclonal antibodies to VWF. Throm Haemost 1999; 82: 1382-5. Furlan M, Robles R, Lämmle B. Partial purification and characterization of a protease from human plasma cleaving von Willebrand factor to fragments produced by in vivo proteolysis. Blood 1996; 87: 4223-34. 25. Levy GG, Nichols WC, Lian EC, et al. Mutations in a member of the ADAMTS gene family cause thrombotic thrombocytopenic purpura. Nature 2001; 6855: 488-94. Mannucci PM, Canciani MT, Forza I, Lussana F, Lattuada A, Rossi E. Changes in health and disease of the metalloprotease that cleaves von Willebrand factor. Blood 2001; 98: 2730-2735. Furlan et al. Von Willebrand factor-cleaving protease in thrombotic thrombocytopenic purpura and the hemolitic uremic syndrome. N Engl J Med 1998; 339: 1578-1584.1998). Tsai H, Lian EC. Antibodies to von Willebrand factor-cleaving protease in acute thrombotic thrombocytopenic purpura. N Engl J Med 1998; 339: 1585-94. Furlan M, Robles R, Solenthaler M, Wassmer M, Sandoz P, Lämmle B. Deficient activity of von Willebrand factor-cleaving protease in chronic relapsing thrombotic trombocytopenic purpura. Blood 1997; 89: 3097-103. Remuzzi G, Galbusera M, Noris M, et al.von Willebrand factor cleaving protease (ADAMTS13) is deficient in recurrent and familial thrombotic trombocytopenic purpura and hemolytic uremic syndrome. Blood 2002; 100: 778-85 Thorell L, Blomback B. Purification of the FVIII complex. Thromb Res 1984;35: 431-449. Kempfer et al, Evaluation of von Willebrand factor cleaving protease independent of von Willebrand factor (VWF). abstract 786. Thromb Haemost July 2001 (suppl).