ANALISIS DE LA COMPOSICION MULTIMERICA DEL VWF

FARIAS CE, KEMPFER AC

FUNDAMENTOS PARA EL MANEJO PRACTICO EN EL LABORATORIO DE HEMOSTASIA

Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis

Lugar: CABA; Año: 2003; p. 307 - 311

ANÁLISIS DE LA COMPOSICIÓN MULTIMÉRICA DEL FACTOR VON WILLEBRAND Fundamento de la técnica La técnica detecta los multímeros del VWF plasmático, mediante un sistema discontinuo de SDS-electroforesis en geles de agarosa (de distinta concentración y pH). El patrón multimérico se visualiza con anticuerpo anti-VWF humano desarrollado en conejo seguido por incubación con anti-IgG de conejo biotinilada desarrollada en cabra. Después de agregar el complejo avidina-biotina-peroxidasa, la actividad de la peroxidasa se detecta por medio de su sustrato, 4-Cl-1-naftol en presencia de H2O2, dando bandas bien definidas sobre un fondo claro (1). Materiales y Métodos -Anticoagulante con anti-proteasas: citrato trisódico3.8%, Na2EDTA 50 mM, N-etilmaleimida 60 mM y aprotinina 2000 KIU/mL. - Tampón fosfato-salino (PBS, pH 7.2): NaPO4H2 0.015 M, NaCl 0.15 M. - Tampón gel de corrida ( pH 8.8): Tris 0.375 M, Sodio dodecil sulfato (SDS) 0,1%. - Tampón gel concentrador (pH 6,8): Tris 0,125 M, SDS 0,1%. - Tampón para dilución de las muestras (pH 8,0): Tris 0.01 M, Na2EDTA 1mM, SDS 2%, azul de bromofenol 0,005%. - Tampón de electroforesis (pH 8,35): Tris 0.05 M, glicina 0.384 M, SDS 0.1%. - Solución de anti-VWF (Dako A082, Dakopatts, Dinamarca) en PBS con 20 mg % de azida sódica: 1 mL de anticuerpo anti ?VWF desarrollado en conejo cada 100 mL de tampón. -Tampón de lavado: Tween 20 al 0,05% en PBS. -Solución de anti-IgG (Dako E353, Dakopatts, Dinamarca) en PBS con 20 mg de azida sódica: 1 mL de anticuerpo anti-IgG de conejo biotinilada desarrollado en cabra cada 100 mL de tampón. -ABPComplex: estreptavidina-biotina-peroxidasa (Dako K377 A y B, Dakopatts, Dinamarca): 100 μl de estreptavidina + 100μl de biotina + 10 mL de PBS. Se incuban 30 min a temperatura ambiente y se agregan 40 mL de PBS. - Solución reveladora: 60mg de 4Cl-1Naftol disueltos en 20 mL de metanol. Se le agregan 80 mL de PBS y 0.6 mL de H2O2 de 30 vol. - Gel de agarosa tipo I al 1% (Sigma A 6013, St Louis, USA) en tampón gel de corrida. - Gel de agarosa tipo I al 0.8% en tampón gel concentrador. - Gel de agarosa tipo I al 1% en tampón de dilución de muestras. Obtención y preparación de los plasmas La sangre se extrae de normales y pacientes en proporción 1:10 con el anticoagulante con anti-proteasas. Se obtiene el plasma pobre en plaquetas por centrifugación a 2500 g durante 20 min a 10°C; el plasma se pasa a otro tubo y se centrifuga nuevamente en las mismas condiciones. Los normales (n=20) se mezclan para obtener un pool (PNP) de referencia que se compara con el estándar internacional para VWF:RCo. Si existe una mutación en la molécula o un efecto proteásico que provoque la disminución o ausencia de estos multímeros, el ensayo resulta anormal. Procedimiento Se vierten 13.5 mL de agarosa al 1% en tampón gel de corrida a 56 °C en una placa de vidrio de 10x8 cm. Una vez gelificada la agarosa se quita un segmento de gel de 2x10 cm, que se reemplaza por 3,5 mL de agarosa al 0.8% en el tampón gel concentrador. Se hacen 6 ranuras cuadradas de 1 cm de lado en esta última área (comenzando a 1 cm del borde izquierdo de la placa y a 0.5 cm de la separación entre el gel concentrador y el gel de corrida) para sembrar 200 μl de las muestras. Estas, se diluyen 1/5 en tampón dilución de las muestras que contiene 1% de agarosa. y se incuban 15 min, a 56 °C antes de sembrar en el gel concentrador. Se efectúa la corrida en tampón de electroforesis a 10 mA y 80 volts hasta que el frente de corrida del azul de bromofenol alcance 1 cm del borde inferior de la placa. Una vez terminada la corrida, el gel se retira de la cuba de electroforesis y se lava con agua destilada 15 min, se seca bajo corriente de aire caliente ó en estufa a 37°C y se sumerge en la solución de anti-VWF en PBS. Al día siguiente, se lava con el tampón de lavado durante 30 minutos y se sumerge durante 4 hs en la solución de anti-IgG biotinilada en PBS. Luego, se lava otros 30 minutos con tampón de lavado y se sumerge en ABP Complex durante 4h. Después de un último lavado por 5 minutos se incuba con la solución reveladora. La reacción se frena con agua corriente y luego la placa se seca a temperatura ambiente. Resultados El análisis y cálculo del % de los multímeros se efectúa en el densitómetro JX330 Sharp y el software Pharmacia. Los geles teñidos se escanean densitometricamente con un Sharp Scanner (JX 330, Hamburg, Germany) usando el software ImageMaster (Pharmacia, Newcastle, England). Se utiliza el valor RF que brinda en forma automática el software. El RF, para el control de la corrida, es fijado en 0 correspondiendo al 100% de multímeros presentes en el control. En la Figura se observa el patrón multimérico del VWF de un plasma normal y de dos pacientes, uno con VWD 2B (ausencia de multímeros grandes) y un paciente con VWD 2A (ausencia de multímeros grandes e intermedios). También se observa la densitometría (perfil multimérico) del patrón multimérico donde, la línea Nº2 señala el RF= 0 asignado al del perfil del plasma normal, mientras que la línea Nº1 muestra que el RF del VWD 2B es = 0,56, y la línea Nº3 RF= 0,80 corresponde al del paciente VWD 2A. Valores de referencia No existen, pues se trata de una técnica cualitativa. Comentarios Alternativamente se puede utilizar una dilución de avidina-peroxidasa 1/100 en PBS en lugar de ABComplex (2). Dicha solución es re-utilizable varias veces, lo que disminuye el costo de la técnica. La preparación exacta del tampón de corrida es fundamental para el buen desarrollo de la corrida. Experimentalmente hemos notado que el Tris parece ser alterado por el NaOH, por lo tanto es imprescindible evitar su uso en la corrección del pH. En ciertas patologías, la presencia de proteínas anómalas ó normales en alta concentración interfiere ocasionando un fondo sobre el patrón multimérico del VWF. El mismo origina resultados erróneos en la visualización. Para la evaluación de los multímeros extragrandes la muestra debe estar diluída al mismo valor de VWF:Ag que el control, pues un exceso del mismo origina falsos positivos. Si el VWF:Ag está disminuído es difícil evaluar si existe una alteración multimérica. En esos casos se deben agrandar las ranuras en longitud para sembrar 300 mL de todas las muestras. Para el paciente se mantiene la dilución 1/5 mientras que para el pool normal se disminuye la cantidad del plasma para igualar las concentraciones. Hemos encontrado que el hecho de no respetar la dilución 1/5 para el pool normal no ocasiona errores en la visualización de la composición multimérica del mismo; ocasiona errores cuantitativos que se soslayan ya que ésta es una técnica cualitativa. Bibliografía 1. M. Aihara, Y. Sawada, K. Ueno, S. Morimoto S, Y. Yoshida, M. de Serres, H. A. Cooper and R. H. Wagner.Visualization of von Willebrand Factor Multimers by Immunoenzymatic Stain Using Avidin-Biotin Peroxidase Complex. Thromb Haemost 1986; 55 (2): 263-267. 2. Farías C, Kempfer A, Blanco A, Woods A, Lazzari MA Thrombosis Research 1989; 53: 513-518.Visualization of the multimeric structure of von Wille-brand factor by immunoenzymatic stain using avidin-pero¬xidase complex instead of avidin-biotin-peroxidase com¬plex.