DETERMINACION DEL ANTIGENO DEL VWF POR ELISA Y CITOMETRIA DE FLUJO

FARÍAS CE, KEMPFER AC

FUNDAMENTOS PARA EL MANEJO PRACTICO EN EL LABORATORIO DE HEMOSTASIA

Grupo Cooperativo Argentino de Hemostasia y Trombosis

Lugar: CABA; Año: 2003; p. 291 - 295

DETERMINACION DEL ANTIGENO DEL VWF POR ELISA Fundamento de la técnica El método emplea microplacas de poliestireno como soporte de anticuerpo anti-VWF humano desarrollado en conejo, al cual se unirá el VWF de las muestras del pool normal y de los pacientes. Posteriormente las microplacas se incuban con anti-VWF humano biotinilado y complejo avidina-biotina-peroxidasa. La actividad de la peroxidasa se detecta por medio de su sustrato, ortofenilendiamina en presencia de H2O2 (1). Materiales y Métodos -Tampón bicarbonato de sodio 0.05 M pH9.6 - Anticoagulante con antiproteasas: (citrato trisódico3.8%, Na2 EDTA 50 mM N-etilmaleimida 60 mM,aprotinina 2000 KIU/mL) - Tampón ELISA (TE): pH 7,3 (NaCl 0.12 M,imidazol 0.02 M ácido cítrico 0.005 M) -anticuerpo anti VWF policlonal ( Dako A082, Dakopatts, Dinamarca) - ortofenilendiamina (OPD , Ortho-Diagnostic Systems) -Tampon Citrato : Citrato de sodio 7,6 mM-Fosfato disódico anhidro 13,2 mM pH:5.0 - Seroalbúmina bovina (BSA) (Sigma A 4503, St Louis, USA) -StreptABComplex/HRP (Dako K377 A y B, Dakopatts, Dinamarca) -Microwells Covalink NH, F8(Nunc, Dinamarca) Obtención y preparación del plasma La sangre se extrae de normales y pacientes en proporción 1:10 con el anticoagulante con anti-proteasas. Se obtiene el plasma pobre en plaquetas por centrifugación a 2500 g durante 20 min a 10°C; el plasma se pasa a otro tubo y se centrifuga nuevamente. Los normales se mezclan para obtener un pool (PNP) de referencia que se compara con el estándar internacional para VWF:Ag. Procedimiento -Incubar 100 µL de una dilución 1/200 de anti VWF humano policlonal en tampón bicarbonato en cada pocillo de la microplaca durante 19 h a 4°C. -Lavar 3 veces con TE. -Incubar 100 µL de 10% de BSA en TE, durante 1 h a 37ºC. -Lavar 3 veces con 0,5 %de BSA en TE. -Incubar 100 µL de las diluciones de PNP para la curva(1/20 a 1280) y las diluciones de las muestras de los pacientes, 2 hs a 37ºC. -Lavar 3 veces. -Incubar 100 µL de anti VWF biotinilado 1/100 en 0,5 %de BSA en TE, 1 h a 37ºC. -Lavar 3 veces. -Incubar con 100 µL de ABComplex en TE durante 30´ a 37ºC. -Lavar 3 veces. -Agregar cada 10´´ a cada pocillo de la microplaca, 100 µL de OPD 1mg/mL en tampón citrato con 4 µL/mL de agua oxigenada de 30 vol. Frenar la reacción con 100 µL de ac. sulfúrico al 1.6%. Resultados Leer a 492 nm y graficar la curva doble log de las diluciones del PNP vs. las lecturas de absorbancia e interpolar los datos de los pacientes. Comentarios Esta técnica tiene menor límite de detección y mayor sensibilidad que la electroinmunodifusión. Es apta para la determinación del VWF:Ag en muestras de medio no plasmático. Bibliografia 1. L D Taylor.The application of the Biotin/Avidin System to the von Willebrand Factor AntigenImmunoassay.ThrombHaemost1988;59(2):251-254.