Silenciamiento del gen ftsZ mediante tecnología antisentido: implicancias en el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas

DAVIES SALA; ALFONSO SOLER BISTUE; A. PETRONI, P. ANDRÉS, A. SOLER BISTUÉ, P. QUIROGA, A. ZORREGUIETA, D. CENTRÓN, M. GALAS; TOLMASKY ME

Buenos Aires

Congreso; XVII Congreso de la Asociación Argentina de Microbiología (AAM),; 2010

Asociacion Argentina de Microbiologia

a proteína FtsZ es un análogo bacteriano de la tubulina, al-tamente conservada en el dominio bacteria y cuyo correcto dosajees clave para la división celular. Una disminución del mismo essuficiente para imposibilitar la supervivencia de la célula. LaARNasa P es capaz de mediar el corte de una molécula de ARNen presencia de un oligorribonucleótido complementario, conoci-do como External Guide Sequence (EGS). Para que cumpla di-cha función, el EGS debe poseer ciertas características que de-terminan la estructura adecuada cuando interacciona con el ARNblanco. La tecnología EGS se ha empleado con éxito para silen-ciar diversos genes bacterianos. Recientemente, hemos determi-nado que oligonucleótidos híbridos que contienen residuos deADN y ácidos nucleicos cerrados (LNA) son resistentes a nu-cleasas bacterianas pero de todas maneras son capaces de in-ducir la actividad de ARNasa P. Estas propiedades les permitengenerar el silenciamiento del gen de resistencia a amikacinaaac(6?)Ib en células naturalmente permeables cuando son admi-nistrados exógenamente. La aplicación de dicha tecnología alsilenciamiento de ftsZ podría llevar a la identificación de EGSs conla capacidad de actuar sinérgicamente con antibióticos existen-tes o, si el efecto es lo suficientemente potente, de constituirseen antimicrobianos de acción independiente. A partir de un mo-delado in silico (mfold webserver) se diseñaron EGSs complemen-tarios a regiones potencialmente accesibles. Estos EGSs marca-dos radiactivamente en el extremo 5? fueron analizados para de-terminar su capacidad de unión al ARNm ftsZ así como de indu-cir su degradación. La unión se determinó por ensayos de cam-bio de movilidad electroforética (EMSA) y la capacidad de inducirdegradación se ensayó por incubación del mensajero radiac-tivamente marcado con las dos subunidades de la ARNasa P(ARN M1 y la proteína C5). Se diseñaron EGSs complementariosa las dos regiones más extensas predichas como simple cadena.De los dos EGSs diseñados se determinó que sólo el dirigidocontra una de dichas regiones (EGS2) fue capaz de unirse al ARNmensajero ftsZ y de inducir el corte en presencia ARNasa P. Dadoque pequeñas diferencias en la posición relativa del EGS puedenresultar en grandes diferencias de actividad, se llevó a cabo unestudio de optimización generando EGSs de la misma longitud,pero corridos solapadamente en una, dos o tres bases hacia cadaextremo con respecto a la secuencia de EGS2. Se determinó quetodos los EGSs fueron capaces de unirse con alta eficiencia y deinducir el corte in vitro del mensajero, uno de ellos con una efi-ciencia superior al resto. Nuestros resultados indican que existeal menos una región en el mensajero ftsZ capaz de interactuarproductivamente con EGSs. Los ensayos de optimización en eldiseño de los EGSs permitieron identificar una secuencia conactividad lo suficientemente alta para llevar a cabo futuros estu-dios de silenciamiento de ftsZin vivo.