Desarrollo de un ensayo para la detección precoz del cáncer cervical.

CHOUHY, DIEGO; CAVATORTA, ANA LAURA; BENITEZ GIL, LISANDRO; NOCITO, ANA LIA; CITTADINI, JORGE; GARDIOL, DANIELA; GIRI, ADRIANA A.

Buenos Aires

Congreso; VIII Congreso Argentino de Virología; 2005

Sociedad Argentina de Virología

El cáncer cervical es una de las neoplasias más comunes que afecta los órganos reproductivos de la mujer. En Latinoamérica ocupa el primer lugar en incidencia, siendo en Bs.As. de 25,4/100.000 mujeres. La prevención del cáncer cervical se basa en la realización periódica del test de Papanicolaou (Pap) y la colposcopía. Sin embargo, se siguen registrando casos de carcinomas cervicales en mujeres controladas periódicamente con el Pap, sugiriendo que esta metodología presenta una limitada sensibilidad para la detección precoz. Ha sido establecido que la infección con tipos oncogénicos de papillomavirus humanos (HPV) es el evento clave en el desarrollo del cáncer cervical. Dada la ausencia en nuestro país de métodos comerciales para la detección de secuencias de HPV, surge la necesidad de desarrollos regionales. El objetivo de este trabajo es el desarrollo de un ensayo molecular para la detección de HPV y tipificación de los 5 tipos oncogénicos de mayor incidencia como herramienta para el diagnóstico precoz del cáncer cervical. Se desarrolló el L1HPVPCR, un ensayo basado en PCR con revelado colorimétrico para la detección de la mayoría de HPV mucosotrópicos y tipificación de los HPV oncogénicos de mayor incidencia (HPV-16,-18,-31,-33,-35), utilizando los cebadores genéricos MY11 y MY09 biotinilado. Los amplicones biotinilados son hibridizados en fase líquida a una sonda genérica conjugada a fluoresceína, capturados a una microplaca revestida con estreptavidina y detectados con anticuerpo anti-fluoresceína conjugado con peroxidasa y un cromógeno. Las muestras HPV-positivas son tipificadas con sondas fluoresceinadas tipoespecíficas para HPV-16,-18,-31,-33 y -35, con un procedimiento similar al descripto para la sonda genérica. El L1HPVPCR resultó ser sensible (10-100 copias de HPV/reacción), reproducible y de fácil ejecución. Para convalidar su aplicabilidad diagnóstica se analizaron 130 muestras de cepillado cervical: 94 con citología normal, 24 lesiones escamosas intraepiteliales de bajo grado (LSIL) y 12 de alto grado (HSIL). El ADN viral fue detectado en el 54% de los casos (70/130), de los cuales el 57% (40/70) pertenecía a HPV oncogénicos. El 55% (52/94) de las muestras con citología normal, fueron negativas en el ensayo molecular. Un resultado doble-negativo (citología normal y ausencia de ADN de HPV oncogénico) indica mejor pronóstico contra futuras lesiones HSIL que tres resultados negativos consecutivos en la citología. El 45% (42/94) restante de las muestras con citología normal presentó secuencias de HPV, detectándose tipos oncogénicos en el 21% (20/94) de las mismas. Mujeres con citología normal que resulten positivas al ADN de HPV oncogénicos presentan un riesgo 100 veces mayor de desarrollar HSIL, respecto a las mujeres negativas para ambas determinaciones. Entre las muestras que presentaron LSIL, el 75% (18/24) fue positiva para HPV, tipificándose HPV oncogénicos en el 42% (10/24). Todas las muestras HSIL que presentaron secuencias de HPV (83%; 10/12) correspondieron a tipos oncogénicos. Además, el L1HPVPCR fue utilizado para demostrar la asociación de HPV en muestras de tejidos embebidos en parafina de mucosa cervical. Este análisis permitió correlacionar la degradación del oncosupresor DLG por la oncoproteína E6 de HPV oncogénicos con los procesos de transformación maligna en el trabajo publicado por nuestro grupo. Considerando la falta de ensayos moleculares comerciales en la región para la detección y tipificación de HPV, el ensayo aquí presentado constituye un instrumento de importancia para un seguimiento eficiente de las mujeres con riesgo de desarrollar cáncer cervical.