“Método para analizar al estado físico del ADN de Papillomavirus Humano tipo 16”

CAVATORTA AL; CHOUHY D; BERCOFF M; CERDA B; BOTTAI H; LEIVA M; MAMPRIN D’ANDREA R; GARDIOL D; GIRI AA

Buenos Aires

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología.; 2008

Sociedad Argentina de Virología (SAV)

En América Latina, el cáncer cervical es la segunda neoplasia más frecuente que afecta a la mujer, después del cáncer de mama. La infección con papilomavirus humanos (HPV) oncogénicos es considerada el factor necesario para el desarrollo de esta patología. Los HPV son un grupo heterogéneo de virus sin envoltura con un genoma de ADN doble hebra circular de aproximadamente 8 kb. Los HPV oncogénicos, como el HPV-16, integran su ADN al genoma celular a través de la ruptura de la región E1/E2 de HPV. E2 codifica para una proteína que regula la transcripción viral y su pérdida permite la expresión de los oncogenes virales, E6 y E7, y el inicio de la transformación celular. Por lo tanto, la integración del ADN viral en el genoma celular es considerada un evento clave en la carcinogénesis asociada a HPV. En nuestra área de Virología, hemos desarrollado un método denominado PCR-16 E2/E6 que combina PCR cualitativa, hibridación liquida de los productos amplificados con sondas específicas no-radioactivas y revelado colorimétrico en un formato de microplaca. Este ensayo permite la co-amplificación de fragmentos de los genes E2 y E6 del HPV-16 en una sola reacción. Los valores de densidad óptica (OD) obtenidos con cada sonda luego de la hibridación líquida y la detección colorimétrica son usados para calcular el cociente E2/E6 y por lo tanto, para estimar el estado físico del ADN viral. En primer lugar, se evaluaron cocientes de referencia E2/E6 para estados episomal, integrado y mixto imitando cada estado físico con plásmidos y análisis estadístico. Se establecieron rangos de variación para cada estado físico para diferenciar las distintas formas del ADN viral. Este criterio fue aplicado para el análisis de muestras clínicas en función de evaluar la utilidad clínica del cociente E2/E6 como una medida del estado físico del HPV-16. Con ese propósito se evaluaron muestras secuenciales de mujeres HPV-16 positivas, encontrándose que el estado físico de HPV-16 determinado con esta estrategia se correlacionaba en un 67% con la evolución clínica. Para verificar si los cocientes E2/E6 obtenidos mediante la metodología cualitativa (Ensayo PCR –16 E2/E6) desarrollada previamente se correlaciona con el estado físico real del ADN de HPV-16, realizamos el desarrollo y optimización de una metodología de PCR en tiempo real para cuantificar el número de copias de los genes E2 y E6. La optimización se llevó a cabo con el plásmido pW12 que contiene una copia completa del genoma de HPV-16, obteniendo curvas de calibración para ambos genes con eficiencias cercanas a los valores óptimos. Posteriormente, comparamos los valores del cociente E2/E6 obtenidos para ambas metodologías obteniendo valores relativos similares. Actualmente estamos comenzando con la estimación y análisis del estado físico del ADN de HPV-16 como marcador de evolución de las lesiones cervicales en las mismas muestras secuenciales de mujeres infectadas con el HPV-16 analizadas con la metodología cualitativa. En conclusión, la PCR en tiempo real permitirá validar el ensayo cualitativo PCR-16 E2/E6 como un método de bajo costo y fehaciente para la evaluación del estado físico del ADN del HPV-16, pudiendo complementar la información obtenida del pap y de la evaluación del ADN del HPV.