Análisis del estado físico del ADN del Papilomavirus tipo 16 por PCR en tiempo real.

ALVAREZ GÖDEKEN ANDRÉS; MAMPRÍN D’ANDREA RUBÉN; BERCOFF MAYARÍ; CHOUHY DIEGO; CAVATORTA ANA LAURA; GIRI ADRIANA A

Universidad Nacional de Entre Ríos. Concordia-Entre Ríos

Jornada; XVII Jornadas de Jóvenes Investigadores de AUGM; 2009

AUGM

La infección con papilomavirus humanos (HPV) oncogénicos es considerada el factor necesario para el desarrollo de cáncer cervical. Los HPV son virus sin envoltura con genoma de ADN doble hebra circular de aproximadamente 8 kb. Los HPV oncogénicos, como el HPV-16, integran su ADN al genoma celular a través de la ruptura de la región E1/E2 de HPV. E2 codifica para una proteína que regula la transcripción viral y su pérdida permite la expresión de los oncogenes virales, E6 y E7, y el inicio de la transformación celular. Por lo tanto, la integración del ADN viral en el genoma celular es considerada un evento clave en la carcinogénesis asociada a HPV. En base a estas consideraciones se ha propuesto al estado físico viral (presencia de formas integradas, episomales o mixtas) como una información de utilidad para definir el pronóstico de progresión del cáncer cervical y su resolución. En nuestro laboratorio hemos desarrollado un método denominado PCR-16 E2/E6 que combina PCR cualitativa, hibridación liquida de los productos amplificados con sondas específicas no-radioactivas y revelado colorimétrico en un formato de microplaca. Este ensayo permite la co-amplificación de fragmentos de los genes E2 y E6 del HPV-16 en una sola reacción. Los valores de densidad óptica obtenidos con cada sonda luego de la hibridación líquida y la detección colorimétrica son usados para calcular el cociente E2/E6 y por lo tanto, permiten estimar el estado físico del ADN viral. En primer lugar, se evaluaron cocientes de referencia E2/E6 para estados episomal, integrado y mixto imitando cada estado físico con plásmidos y análisis estadístico. Se establecieron rangos de variación para cada estado físico para diferenciar las distintas formas del ADN viral utilizando un modelo de regresión logit generalizado con respuesta politómica y variable regresora continua. Este criterio fue aplicado para el análisis de muestras secuenciales de un grupo de mujeres infectadas persistentemente con el HPV-16 a fin de evaluar la utilidad clínica del cociente E2/E6 como marcador de evolución de las lesiones asociadas a ese tipo viral. En este análisis determinamos que el estado físico de HPV-16 se correlacionaba en un 67% con la evolución clínica. Para verificar si los cocientes E2/E6 obtenidos mediante la metodología cualitativa se correlacionaban con el estado físico real del ADN de HPV-16, desarrollamos y optimizamos una metodología de PCR en tiempo real para cuantificar el número de copias de los genes E2 y E6. La optimización se llevó a cabo con el plásmido pW12 que contiene el genoma completo de HPV-16, obteniéndose curvas de calibración para ambos genes con eficiencias cercanas a los valores óptimos. Posteriormente, comparamos los valores del cociente E2/E6 arrojados por cada metodología obteniendo valores relativos similares. Actualmente estamos comenzando con la estimación y análisis del estado físico del ADN de HPV-16 como marcador de evolución de las lesiones cervicales en las muestras previamente analizadas con la metodología cualitativa. En conclusión, la PCR en tiempo real permitió validar el ensayo cualitativo PCR-16 E2/E6 como un método de bajo costo y fehaciente para la evaluación del estado físico del ADN del HPV-16, pudiendo complementar la información obtenida del PAP y de la evaluación del ADN del HPV.