Desarrollo de un instrumento para la detecci¨®n precoz del c¨¢ncer cervical.

CHOUHY, DIEGO; CAVATORTA, ANA LAURA; BENITEZ GIL, LISANDRO; NOCITO, ANA LIA; CITTADINI, JORGE; GARDIOL, DANIELA; GIRI, ADRIANA A.

Buenos Aires

Congreso; Congreso Internacional-Grupo Biotecnolog¨ªa, VI Simposio Nacional de Biotecnolog¨ªa, REDBIO Argentina 2005; 2005

REDBIO

Introducci¨®n El c¨¢ncer cervical es una de las neoplasias m¨¢s comunes que afecta los ¨®rganos reproductivos de la mujer. En Latinoam¨¦rica ocupa el primer lugar en incidencia, siendo en Bs.As. de 25,4/100.000 mujeres (Golijow et al, 2005). La prevenci¨®n del c¨¢ncer cervical se basa en la realizaci¨®n peri¨®dica del Papanicolaou (Pap) y la colposcop¨ªa. Las lesiones cervicales se clasifican seg¨²n su severidad en lesiones escamosas intraepiteliales  de bajo o alto grado (LSIL o HSIL) e invasivas. El Pap ha contribuido a reducir la incidencia del c¨¢ncer cervical. Sin embargo, el diagn¨®stico de neoplasias cervicales en mujeres controladas peri¨®dicamente con el Pap  sugiere que esta metodolog¨ªa ha llegado al l¨ªmite de su sensibilidad para la detecci¨®n precoz. Ha sido establecido que la infecci¨®n con tipos oncog¨¦nicos de papillomavirus humanos (HPV) es el evento clave en el desarrollo del c¨¢ncer cervical (Zur Hausen, 1996). Adem¨¢s, las infecciones persistentes con HPV oncog¨¦nicos en mujeres con lesiones cervicales aumenta el riesgo de progresi¨®n a c¨¢ncer en el tiempo. La imposibilidad de cultivar el virus, el escaso significado de las pruebas serol¨®gicas y la reducida sensibilidad de la inmunohistoqu¨ªmica, indica la b¨²squeda de ¨¢cidos nucleicos virales como la mejor estrategia de diagn¨®stico de HPV. Dada la ausencia en nuestro pa¨ªs de m¨¦todos comerciales para la detecci¨®n de secuencias de HPV, surge la necesidad de desarrollos regionales.  El objetivo de este trabajo es el desarrollo de un ensayo molecular para la detecci¨®n de HPV y tipificaci¨®n de los 5 tipos oncog¨¦nicos de mayor incidencia como herramienta para el diagn¨®stico precoz de c¨¢ncer cervical. Metodolog¨ªa Se desarroll¨® el L1HPVPCR, un ensayo basado en la Reacci¨®n en Cadena de la Polimerasa (PCR) con revelado colorim¨¦trico para la detecci¨®n de HPV mucosotr¨®picos y tipificaci¨®n de los HPV oncog¨¦nicos de mayor incidencia (16,18,31,33,-35). Se optimiz¨® la t¨¦cnica de PCR con los cebadores gen¨¦ricos MY11 y MY09 biotinilado (Manos et al, 1989), que permiten amplificar un fragmento altamente conservado de la prote¨ªna mayor del c¨¢pside L1 de los HPV mucosotr¨®picos. Los amplicones biotinilados son hibridizados en fase l¨ªquida a una sonda gen¨¦rica conjugada a fluoresce¨ªna, capturados a una microplaca revestida con estreptavidina y detectados con anticuerpo anti-fluoresce¨ªna conjugado con peroxidasa y un crom¨®geno (Figura 1). Las muestras HPV-positivas son tipificadas con sondas fluoresceinadas tipo-espec¨ªficas para HPV-16,-18,-31,-33 y -35, con un procedimiento similar al descripto para la sonda gen¨¦rica. La idoneidad de muestras HPV-negativas es verificada mediante amplificaci¨®n de un fragmento del gen de ¦Â-globina humana (Figura 1). Resultados y Discusi¨®n El L1HPVPCR fue sensible (10-100 copias de HPV/reacci¨®n), reproducible y de f¨¢cil ejecuci¨®n. Para convalidar su aplicabilidad diagn¨®stica se analizaron 130 muestras de cepillado cervical (Tabla 1): 94 con citolog¨ªa normal, 24 LSIL y 12 HSIL. El ADN viral fue detectado en el 54% (70/130), de los cuales el 57% (40/70) pertenec¨ªa a HPV oncog¨¦nicos. El 55% (52/94) de las muestras con citolog¨ªa normal, fue concordante en el ensayo molecular. Un resultado doble-negativo (citolog¨ªa normal y ausencia de ADN de HPV oncog¨¦nico) indica mejor pron¨®stico contra futuras lesiones HSIL que tres resultados negativos consecutivos en la citolog¨ªa. El 45% (42/94) restante de las muestras con citolog¨ªa normal present¨® secuencias de HPV, detect¨¢ndose tipos oncog¨¦nicos en el 21% (20/94) de las mismas. Mujeres con citolog¨ªa normal que resulten positivas al ADN de HPV oncog¨¦nicos presentan un riesgo 100 veces mayor de desarrollar HSIL, respecto a las mujeres negativas para ambas determinaciones. Entre las muestras que presentaron LSIL, el 75% (18/24) fue positiva para HPV, tipific¨¢ndose HPV oncog¨¦nicos en el 42% (10/24). Todas las muestras HSIL que presentaron secuencias de HPV (83%; 10/12) correspondieron a tipos oncog¨¦nicos. La regresi¨®n de las lesiones siempre tiene lugar posteriormente a la erradicaci¨®n viral, lo cual podr¨ªa explicar el resultado negativo para HPV en 6 de las muestras LSIL y 2 HSIL. Adem¨¢s, el L1HPVPCR fue utilizado para demostrar la asociaci¨®n de HPV en muestras de tejidos embebidos en parafina de mucosa cervical. Este an¨¢lisis permiti¨® correlacionar la degradaci¨®n del oncosupresor h-Dlg por la oncoprote¨ªna E6 de HPV oncog¨¦nicos con los procesos de transformaci¨®n maligna en el trabajo publicado por nuestro grupo (Cavatorta et al, 2004). Conclusiones Estos resultados indican al L1HPVPCR como una herramienta de alta sensibilidad para la detecci¨®n precoz del c¨¢ncer cervical. Considerando la falta de acceso a los ensayos de detecci¨®n y tipificaci¨®n de HPV comerciales, el ensayo aqu¨ª presentado constituye un instrumento de importancia para asegurar la calidad y continuidad de los resultados, y permitir un seguimiento m¨¢s eficiente de las mujeres con riesgo de desarrollar c¨¢ncer cervical. Biotina           Fluoresce¨ªna anti-Fluoresce¨ªna conjugado a peroxidasa Amplificaci¨®n de ¦Â-globina HPV - Tipificaci¨®n HPV + Reactivo    crom¨®foro peroxidasa F B Detecci¨®n en Microplaca Hibridaci¨®n en fase l¨ªquida  Amplificaci¨®n L1 de HPV