Alteraciones estructurales y funcionales de Tirosinasa fotoinducidas por Ptr

BEATRIZ ZURBANO; ALDANA D. GOJANOVICH; ANDRÉS H. THOMAS; M. LAURA DÁNTOLA

Córdoba

Congreso; Segunda Reunión de Fotobiólogos Moleculares Argentinos (II GRAFOB); 2013

Grupo Argentino de Fotobiología-Univer. Nacional de Córdoba

La radiación UV, es la porción más energética del espectro solar que alcanza la superficie terrestre. Este tipo de radiación es capaz de modificar la estructura química de ciertas macromoléculas (proteínas, ácido desoxirribonucleico (ADN)), generando alteraciones que pueden conducir a la muerte celular. Las pterinas, son una familia de compuestos orgánicos heterocíclicos ampliamente distribuidos en la naturaleza que participan en diversas reacciones metabólicas. Se ha demostrado que estas moléculas pueden actuar como fotosensibilizadores, es decir, absorber radiación y producir cambios químicos en un segundo compuesto que actúa como sustrato. Actualmente, se sabe que las pterinas son capaces de oxidar ADN [1,2] y nucleótidos [3,4] mediante procesos fotosensibilizados, sin embargo, se desconoce su acción sobre proteínas. El vitiligo es una patología cutánea que cursa con déficit de la pigmentación a causa de la inactivación de enzimas de la biosíntesis de melanina (melanogénesis). Se ha demostrado, que en la piel de estos pacientes existe acumulación de derivados pterínicos junto a altos niveles de peróxido de hidrógeno (H2O2).[5] La tirosinasa es una cuproglicoproteína que cataliza las dos primeras etapas de la melanogénesis en la piel del ser humano. A pesar de que se reconoce que las pterinas podrían estar involucradas en la fisiopatología del vitiligo, no existen estudios sobre la capacidad de estas moléculas para inactivar enzimas de la melanogénesis. En este contexto, el objetivo de este trabajo es estudiar la capacidad de Pterina (Ptr) para inactivar fotoquímicamente a la tirosinasa, como así también evaluar el daño estructural que sufre la proteína en este proceso. Para esto, soluciones acuosas conteniendo la enzima y Ptr fueron expuestas a radiación UV-A (exc = 350nm) durante distintos períodos de tiempo (pH = 6,5, 25 ºC). Una vez terminada la irradiación, se realiza el ensayo de medida de la actividad enzimática ((pH = 6,5, 37 ºC), el cual consiste en monitorear el aumento de la absorbancia a 475 nm, correspondiente a la formación de L-Dopacroma, en función del tiempo de reacción. [6] Por otra parte, para evaluar el daño a nivel estructural, las soluciones irradiadas son analizadas por electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) y espectroscopía de fluorescencia. Los resultados obtenidos indican que la Ptr es capaz de fotoinactivar a la tirosinasa, sugiriendo que la reacción se inicia con una transferencia de electrones de la enzima al estado excitado triplete del fotosensibilizador, generando el radical catión de la enzima y el radical anión del fotosensibilizador. El radical catión de la enzima puede sufrir procesos de oxidación que conducen a la inactivación irreversible de la enzima. Mientras que el radical anión del fotosensibilizador puede reducir al oxígeno disuelto (O2) para generar el radical anión superóxido.7 Por otra parte, el análisis por SDS-PAGE de las soluciones irradiadas muestra que la enzima sufre una ruptura irreversible generando productos de menor peso molecular. Respecto al estudio del daño que sufre la tirosinasa a nivel de su estructura primaria, se observó que de los aminoácidos que le confieren fluorescencia a las proteínas, en este caso, el triptófano es el aminoácido que sufre alteración en el proceso fotosensibilizado. Referencias 1 Ito K. y Kawanishi S. Biochem., 36, 1774 (1997) 2 Lorente, C.; Thomas, A. H.; Villata, L. S.; Hozbor, D.; Lagares, A.; Capparelli, A. L. Pteridines, 11, 100 (2000) 3 Petroselli, G.; Erra-Balsells, R.; Cabrerizo, F. M.; Lorente, C.; Capparelli, A. L.; Braun, A. M.; Oliveros, E.; Thomas, A. H. Org. Biomol. Chem., 5, 2792 (2007) 4 Petroselli, G.; Dántola, M. L.; Cabrerizo, F. M.; Capparelli, A. L.; Lorente, C.; Oliveros, E.; Thomas A. H. J. Am. Chem. Soc., 130, 3001 (2008) 5 Schallreuter K. U., Wood J. M., Pittelkow M. R., Gutlich M., Lemke K. R., Rodl W., Swanson N. N., Hitzemann K., Ziegler I. Science, 263, 1444 (1994) 6 Pomerantz, S. H.; Li, J. P. C. Method Enzimol., 17, 620 (1970) 7 Dantola M. L.; Gojanovich A. D., Thomas A. H., Biochem. Biophys. Res. Commun, 424, 568 (2012)