Caracterización de la enzima málica NADP-dependiente de Nicotiana tabacum

MARÍA V. LARA; GABRIELA L. MÜLLER; MARÍA F. DRINCOVICH; CARLOS S. ANDREO

La Pampa

Congreso; Sociedad Argentina de Fisiología Vegetal; 2004

El principal objetivo de este estudio es caracterizar las distintas isoformas de la enzima málica NADP (EM-NADP) en Nicotiana tabacum, una especie C3. La EM-NADP cataliza la decarboxilación oxidativa del l-malato produciendo piruvato, CO2 y NADPH. En plantas superiores, isoformas citosólicas y plastídicas han sido detectadas, reflejando la variedad de funciones que desempeña en el metabolismo de la planta (Drincovich et al., 2001). La forma más estudiada en plantas es la enzima decarboxilante primaria en la fotosíntesis C4 (Rothermel & Nelson, 1989) que participa en un mecanismo concentrador de carbono. Se ha detectado en tabaco y apio una enzima málica asociada a las vainas vasculares en tallos y pecíolos de estas plantas C3, hipotetizándose sobre la presencia de un ciclo tipo C4 del cual pudo haberse originado el ciclo operante en plantas C4 (Hibberd & Quick, 2002). En el presente trabajo se encontró actividad EM-NADP en hoja, raíz y tallo de tabaco. Valores de 1,06; 0,65 y 0,81 U/mg de proteína fueron medidos a pH 7.8 en extractos crudos de los tejidos mencionados. Geles nativos revelados por actividad EM-NADP indicaron que en todos estos tejidos la enzima migra en forma más retardada con respecto a la EM-NADP fotosintética presente en hojas de maíz. La menor movilidad fue obtenida para la isoforma presente en raíces de tabaco que se comporta igual a la isoforma de raíces de maíz. La EM-NADP presente en tallos y hojas de tabaco presentó una movilidad intermedia. Estos geles fueron electrotransferidos a membranas de nitrocelulosa e incubados con anticuerpos obtenidos contra las EM-NADP de 62 y 66 kDa presentes en hojas y raíces de maíz respectivamente (Saigo et al., 2004). En ambos casos, las bandas de actividad visualizadas en los diferentes tejidos de tabaco reaccionaron con los anticuerpos usados, confirmando la identidad de enzima málica de la actividad previamente medida. Las bandas con actividad EM-NADP presentes en tallos y hojas de tabaco fueron escindidas y corridas en un SDS-PAGE y reveladas por Western Blot utilizando anticuerpos contra la EM-NADP de raíces de maíz. En ambos tejidos de tabaco se observó una sola banda inmunoreactiva de aproximadamente 66 kDa. Isoelectroenfoques realizados en condiciones nativas y revelados por actividad mostraron la presencia de dos isoformas en cada uno de los tres tejidos de tabaco analizados, siendo los puntos isoeléctricos de 5,65 y 6,95 para hoja;  de 5,15 y 6,95  para raíz y de 5,61 y 7,0 para tallo. En conclusión, se han encontrado varias isoformas de la EM-NADP en diferentes tejidos de tabaco las cuales presentan mayor similitud con isoformas no fotosintéticas descriptas para otras plantas (Drincovich et al., 2001). En la actualidad se está intentando clonar los ADNc que codifican para dichas isoformas