Determinación de la composición aminoacídica de mieles de la provincia de Córdoba

COMETTO, P.; RUBIO, M.; DI PAOLA, R., FAYE, P.; ALDAO, M.

Cordoba

Jornada; VII Jornadas de Bioquímica Clínica de Córdoba.; 2000

OBJETIVOS:  Determinar la composición aminoacídica de mieles de la provincia de Córdoba a los fines de  su caracterización fitogeográfica. Poner a punto una técnica para su determinación por HPLC. METODOS: Las muestras de 5 grs. de miel con 25 ul de norleucina 76 umol/ml (testigo interno) fueron diluidas en 20 ml de buffer fosfato (PH: 2,12). Los aminoácidos fueron prepurificados y concentrados en una columna de intercambio iónico (65x11 mm, Amberlite IR-120) activada con 15 ml de NaOH 2N, agua mili-Q, 15ml de HCL 2N y agua nuevamente; finalmente se equilibra con Buffer fosfato. Se pasó la muestra por la columna donde los aminoácidos fueron retenidos. Luego del lavado con 6 volúmenes de columna de agua los aminoácidos fueron eluidos con 10 ml de NH4OH 2M. La alícuota de 10 ml a recolectar se determinó con feolftaleína. Se fijó el flujo durante todo el proceso en 0.7 ml/min. con una bomba peristáltica. Los aminoácidos se derivatizaron llevando a sequedad 300 ul del eluído, en evaporador rotatorio. Se agregaron 70ul de etanol, 10 ul de H20 y 10ul de trietilamina, luego de llevar nuevamente a sequedades agregaron 20 ul de solución derivatizante (70 ul de etanol, 10 ul de H20, 10 ul de Trietilamina y 10 ul de fenilisotiocianato), se dejó reposar 20 minutos a temperatura ambiente y se evaporó 20 minutos a sequedad. Se lavó 2 veces con acetonitrilo llevando a sequedad. Las muestras derivatizadas se redisolvieron en 200ul de una mezcla de acetonitrilo (40ul) y solvente de corrida A (160ul). Se inyectaron 20 ul de esta solución en el cromatografo (Konik-500-A-Series). La cromatografía fue de fase reversa empleando una columna C18 de 25 cm. Como solvente de elución se hizo un gradiente mezclando dos solventes en distintas proporciones. Solvente A: Acetato de sodio 0.14 M y 1.5 ml de trietilamina, se llevó a PH 6,4 con acido acético, a 760 ml de esa mezcla se le agregó 60 ml de acetonitrilo. Solvente B: 400 ml de H2O y 600 ml de acetonitrilo. La detección de los feniltiocarbamil derivados se realizó a 254 nm con un detector Konik UV-Vis-200. El flujo fue de 1 ml/min y la corrida se completó en 25 minutos. Se utilizaron como testigos externos aminoácidos puros (Sigma-Aldrich Chem. Co.) con los cuales se realizaron curvas de calibración individuales y en mezclas para identificar los tiempos de retención y los indices de respuesta de las áreas. Las curvas de  calibración se obtienen graficando el cociente entre el área correspondiente a una determinada concentración  y el área de una cantidad fija y conocida del testigo interno. RESULTADOS:  Se verificó la eficacia de la cromatografía de intercambio iónico a los fines de eliminar los interferentes observados al inyectar muestras con una simple dilución (1/10) y posterior filtrado (0.45 um) en las cuales no se podía distinguir los picos correspondientes a los aminoácidos. Se obtuvo un valor promedio de recuperación de los diferentes aminoácidos de 109 %. En los cromatogramas se logró una resolución aceptable para la complejidad de la matriz y cantidad de picos para 19 aminoácidos pudiéndose cuantificar 13 según el stock de estándares externos. Los valores de reproducibilidad  sobre 3 repeticiones de una misma muestra también fueron aceptables para la complejidad de la matriz, mejorando en  3 repeticiones de estándares externos. CONCLUSIÓN:  Con la técnica descripta se obtienen valores aceptables a los fines de determinar los perfiles de composición aminoacidica de la miel pudiendo ser una Herramienta importante para su caracterización fitogeográfica. La purificación de los aminoácidos por cromatografía de intercambio iónico presenta importantes beneficios con las técnicas encrontradas en bibliografía para otras matrices.