Caracterización y purificación parcial de la Hexosaminidasa de ovocitos de Bufo arenarum.

MORALES, ENRIQUE S., MARTÍNEZ, MARÍA L. Y CABADA MARCELO O

Rosario

Congreso; VII Congreso, XXV Reunión anual de la Sociedad de Biología de Rosario; 2005

Sociedad de Biología de Rosario.

Los ovocitos de Bufo arenarum están rodeados de una matriz glicoproteica llamada envoltura vitelina (EV). Se ha atribuido a los restos de carbohidratos de esta envoltura un rol central en la interacción con receptores espermáticos y la inducción de la reacción acrosómica en varias especies de animales. Una vez activados los ovocitos se produce la reacción cortical por la cual se libera el contenido de los gránulos corticales (CGC) convirtiendo la EV en envoltura de fecundación (EF). Este proceso inhibe la penetración de otros espermatozoides previniendo la polispermia. En trabajos anteriores se informó que restos N-acetil galactosamina estaban presentes en la EV pero no en EF, sugiriendo que los mismos son removidos durante la transformación de la envoltura. En el presente trabajo hemos determinado la presencia de distintas glicosidasas en extractos totales de ovocitos. La mayor actividad detectada fue la una hexosaminidasa. Esta cataliza la hidrólisis de residuos terminales N-acetil glucosamina y/o N-acetil galactosamina, resultando entonces de particular interés su caracterización y purificación. La enzima presentó un pH óptimo de 3,25 y una temperatura óptima de 55°C. Mediante análisis de Western blot utilizando anticuerpos anti-hexosaminidasa heterólogos se detectó la presencia de una banda antigenicamente relacionada, de ~65 kDa, tanto en el extracto total de ovocitos como en el CGC. Esto sugiere que la hexosaminidasa de ovocitos de Bufo arenarum estaría presente al menos en los gránulos corticales. Al intentar aislarla el vitelo del ovocito fue eliminado con polivinilpirrolidona al 3%. Mediante esta técnica logramos purificarla 4,5 veces manteniendo su rendimiento cercano al 93%. También hemos utilizado etapas cromatográficas posteriores. Las mas eficientes fueron las realizadas con matrices de Phenyl-Sepharose y ConA-Sepharose. Con ellas obtuvimos purificaciones de 5 y 15 veces respectivamente con un rendimiento aproximado entre el 35 y 45%. Además la interacción con la última matriz demuestra que la hexosaminidasa presenta restos glicosídicos Manosa y/o Glucosa y/o NacGlucosamina. Esta glicosidasa también fue retenida en soportes de DEAE-Sepharose equilibradas en búferes de pH=5.0 sugierendo que su pI sería menor o igual a dicho valor. Conclución: Se ha demostrado que en ovocitos de Bufo arenarum la principal actividad glicosídica es la hexosaminidasa. La misma estaría presente al menos en CGC y tendría un posible rol en la conversión de la CV en CF. Además presenta propiedades enzimáticas similares a otras hexosaminidasas informadas.