Análisis de la reacción acrosomal en tiempo real

ZOPPINO, FELIPE CARLOS MARTIN; HALÓN, NARCISO DANIEL; BUSTOS, MATIAS; PAVAROTTI MARTIN; MAYORGA, LUIS SEGUNDO

Centro Atómico Constituyentes, Buenos Aires.

Congreso; II Congreso de la Sociedad Argentina de Microscopia (SAMIC).? Análisis de la reacción acrosomal en tiempo real?. FCM Zoppino. 18 al 21 de abril del 2012. Centro Atómico Constituyentes, Buenos Aires.; 2012

Sociedad Argentina de Microscopia (SAMIC)

La reacción acrosomal (RA) es un evento único en la vida de los espermatozoides, involucra la fusión del acrosoma, una vesícula especializada ubicada en la parte anterior de la cabeza del espermatozoide, con la membrana citoplasmática. Durante la RA se produce la exocitosis del contenido acrosomal y la concomitante liberación de vesículas híbridas formadas por zonas de la membrana externa del acrosoma y zonas de la membrana plasmática. Este proceso manifiesta profundos cambios en la topología del espermatozoide exponiendo proteínas de la membrana acrosomal interna, esenciales para el reconocimiento entre el espermatozoide y el óvulo y para la fusión de los mismos [1]. La aglutinina de Pisum sativum (PSA) es una lectina dimérica con alta afinidad por α-D-manosa y α-D-glucosa [2]. Esta lectina conjugada con isotiocianato de fluoresceína (PSA-FITC) reconoce varias de las proteínas altamente glicosiladas presentes en el acrosoma de distintas especies animales. PSA-FITC ha sido ampliamente utilizada para evaluar la RA en espermatozoides humanos fijados [3], en esta condición PSA-FITC marca la región acrosómica de los espermatozoides sin reaccionar. Luego de la dispersión del contenido acrosomal provocada por la RA, PSA-FITC es incapaz de detectar el acrosoma o sólo puede marcar la región ecuatorial, que conserva parte del contenido acrosomal después de la exocitosis. En el presente estudio desarrollamos una nueva técnica basada en el uso de PSA-FITC para analizar la RA en tiempo real por microscopía confocal. Durante la incubación de espermatozoides humanos en presencia de PSA-FITC, es posible detectar la RA mediante un rápido aumento de la fluorescencia en la región acrosomal. Este incremento inicial se continúa por un aumento de fluorescencia a menor velocidad sostenida por varios minutos. Además es factible determinar la viabilidad de los espermatozoides incubándolos simultáneamente con ioduro de propidio (PI) (figura 1). El análisis por microscopía electrónica demuestra que en presencia de PSA-FITC las vesículas híbridas formadas durante la RA son retenidas en la región anterior de la cabeza del espermatozoide, previniendo así la dispersión del contenido acrosomal (figura 2). En conclusión, hemos desarrollado una nueva técnica para la observación de la RA en células vivas que permite la determinación de parámetros de cinética de RA, porcentaje de RA y viabilidad celular.