Selección de dominios LOVs para su caracterización y mutación desde el metagenoma de Laguna Diamante para la búsqueda de nuevas propiedades fluorescentes

ALBA LOTO; ABATEDAGA, INES; LORENA VALLE; MARIA EUGENIA FARIAS; PAULA C. JAIME; VIRGINIA H. ALBARRACÍN

Bariloche

Congreso; IV Reunión de Fotobiólogos Moleculares Argentinos; 2018

Grupo Argentino de Fotobiología

Las proteínas fluorescentes pueden utilizarse como ?reporters? proteicos que permiten el estudiode diversos procesos celulares. A partir de la posibilidad de usar flavoproteínas (que contienenFMN, Flavin-mononucleótido y FAD, Flavin-adenin-dinucleótido) para generar mutantes condiversas características de fluorescencia en condiciones de baja o nula concentración de O2, surgeel interés de buscar nuevas proteínas con dominios Light-Oxygen-Voltage (LOV) putativos enmetagenomas de ambientes poliextremófilos. La presencia de aminoácidos conservados, conroles tanto en la fotoquímica, como en la estabilización y demás interacciones con la flavina,permite detectar in silico la presencia de dominios LOV. Las mutaciones puntuales sobre dichosaminoácidos modifican las propiedades espectroscópicas de éstas proteínas permitiendo explorarsu capacidad como proteínas fluorescentes con posibles aplicaciones biotecnológicas.La búsqueda de estos dominios putativos se realizó en el metagenoma de los biofilmspertenecientes a la laguna Diamante (PRJNA236999), localizada en el interior del volcán Galán(Catamarca, Argentina) a 4589 msnm. La selección de dominios LOV candidatos se obtuvo através del programa BLAST usando la secuencia LOV2 perteneciente a Avena sativa, comoprimera estrategia, y luego utilizando múltiples secuencias consenso no superiores a 20aminoácidos de dominios LOV ya conocidos, como estrategia alternativa. A partir la primera, lassecuencias candidatas fueron Ga0151614_185661, Ga0151614_194791 y Ga0141614_151402,por presentar el mayor número de residuos considerados clave para la arquitectura especifica dedichos dominios. Ga0141614_151402 fue producida heterologamente y purificada, junto con dosmutantes, 151402-CA y 151402-CS.Bajo las condiciones de inducción y purificación establecidas, no se registró la presencia deholoproteína con la unión no covalente al FMN característica. Las proteínas fueron desplegadas eincubadas con FMN, consiguiendo sólo apoproteína, en el mejor de los casos, con débilesinteracciones no permanentes. Estos resultados ponen en discusión el criterio que debe tomarseante la selección de secuencias a partir de una base de datos.Utilizando la segunda estrategia de búsqueda, se obtuvo como resultado nuevas candidatas, y seseleccionaron dos nuevas secuencias Ga0151614_169051 y Ga0151614_106091 (que poseen lasuperfamilia PRK15347 en su arquitectura-Pfam). Se propone extender el análisis a la arquitecturadel ORF para obtener una perspectiva más acertada sobre el resultado, considerando lascaracterísticas de los organismos presentes en estos ambientes tan peculiares